白藜芦醇对急性心肌梗死大鼠心脏神经重塑的影响及其机制

姜晓晓，周祖华，常栋，齐中华

（1. 大连医科大学附属第一医院心脏外科，辽宁 大连 116011； 2. 辽宁省军区大连第十六离职干部休养所门诊部，辽宁 大连 116041；3. 大连医科大学附属第一医院心内科，辽宁 大连 116011；4. 大连医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 大连 116011）

研究［1］显示，急性心肌梗死患者中心源性猝死占50%。研究［2］发现心肌梗死后心脏神经重塑，梗死区神经纤维坏死，局部去神经，随后出现交感神经芽生，造成非梗死区交感神经密度增加，从而增加了心脏对室性心律失常和心源性猝死的易感性。神经生长因子 （nerve growth factor，NGF） 是神经营养因子，对交感神经的损伤修复具有重要作用［3］。研究［4］发现心肌梗死3.5 h后心肌组织中的神经生长因子明显增加，随后引起交感神经芽生。心肌梗死后，白细胞介素1 β （interleukin-1 β，IL-1 β） 促进炎症反应却延迟肌成纤维细胞活化。向心肌缺血的犬左星状神经节内注射IL-1 β，可以通过调节神经重塑增加室性心律失常的发生［5］。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，存在于多种植物 （花生、虎杖、葡萄等） 。研究［6］表明白藜芦醇具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗氧化、诱导细胞凋亡等生物学活性。本研究探讨白藜芦醇对心肌梗死大鼠心脏神经重塑的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

8周左右、雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量200 g，由大连医科大学附属第一医院动物实验中心提供。实验得到大连医科大学动物伦理委员会批准。白藜芦醇购于美国 sigma 公司。

1.2 心肌梗死模型建立及分组

大鼠腹腔内注射10%水合氯醛 （300 mg/kg） 麻醉，切开气管进行插管，利用小动物呼吸机为大鼠辅助通气 （呼吸频率设定为65次/min，呼吸潮气量设定为2.5 mL） 。沿左胸第5肋间剪开心包后，手术线结扎前降支近心端2 mm处冠状动脉建立心肌梗死模型［7］。Sprague-Dawley大鼠随机均分为3组：假手术组 （n = 10，缝线穿过冠状动脉前降支下方但不结扎） 、手术组 （n = 10，结扎冠状动脉前降支） ，手术给药组［n = 10，结扎冠状动脉前降支同时前降支注射白藜芦醇 （40 mg/kg） ］。

1.3 电生理刺激检测

大鼠手术4周后进行电生理刺激检测。麻醉开胸后将电极放在右心室心外膜，给予体外电刺激（电刺激仪，四川科仪诚科技有限公司，QL/N-IV ） 。刺激程序：共11次刺激，包括起搏刺激 （8次，时间间隔160 ms） 和额外刺激 （3次，第1次和第2次时间间隔为100 ms，第2次和第3次时间间隔50 ms） 。心律失常判断标准［7］：心律失常＜6次，正常； 6次≤心律失常＜15次，非持续性室性心律失常；心律失常≥15次，持续性室性心律失常。

1.4 Western blotting检测

在冰盒上取手术组、手术给药组大鼠心肌梗死周边心肌组织（200 mg），假手术组大鼠心肌组织选取与心肌梗死组大鼠相同区域，用1 mL组织裂解液裂解组织。匀浆后放入1.5 mL EP管中1 3000 r/min，4 ℃，15 min离心，取上清用于后续蛋白实验。用BCA法测蛋白浓度，将蛋白浓度调整为3 μ g/μ L，配置12%浓度分离胶10 mL，5%浓度积层胶4 mL，上样量为20 μ L，电泳设置电压80 V，30 min，然后电压120 V，60 min，电压100 V湿转蛋白到PVDF膜上60 min，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜室温1 h，加入一抗NGF（ 1∶1 000） 、IL-1b（ 1∶1 000） 、GAPDH（ 1∶4 000） ，排除气泡，封口后4 ℃过夜。TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀释后到二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。增强发光液显影。使用Image J软件进行蛋白的灰度分析，目的蛋白采用目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值表示。实验重复3次。

1.5 实时 PCR检测

手术后4周，剪取心肌梗死附近组织（假手术组大鼠心肌组织选取与心肌梗死组大鼠相同区域 ，约200 mg），使用1 mL Trizol裂解，匀浆器进行匀浆，Vertex震荡30 s，加入0.2 mL 氯仿，震荡30 s后 室 温 放 置3～5 min， 12 000 r/min， 4 ℃离心15 min，吸取上层水相放入EP管，加等体积异丙醇，混匀后室温放置30 min；然后12 000 r/min，4 ℃离心10 min后弃掉上清，加入75%乙醇（ 1 mL） ，7 500 r/min，4 ℃离心10 min后弃掉上清，室温干燥10 min，溶于DEPC水用于后续实验。NGF引物序列：上 游 5’-TCCACCCACCCAGTCTTCCA-3’，下游5’-GCCTTCCTGCTGAGCACACA-3’；IL-1b引 物 序列：上 游 5’-GGGATGATGACGACCTGC-3’，下 游5’-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3’； GAPDH引 物 序列：上 游 5’-CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。相对表达量参照内参基因GAPDH标准化，所有反应重复3次，数据用 2-ΔΔCt方法计算。

1.6 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行数据分析，数据采用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA） 。心律失常评分是非正态分布，采用Kruskal-Wallis非参数检验。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠心律失常诱导结果

大鼠手术4周后心律失常检测结果显示，假手术组大鼠未发生室性心律失常。手术组中8只 （80%）发生室性心律失常，手术给药组5只 （50%）发生室性心律失常；2组比较差异有统计学意义 （P ＜ 0.05） 。

2.2 3组大鼠心肌组织中NGF、IL-1 β mRNA及蛋白表达

结果显示，与假手术组比较，手术组、手术给药组心肌组织NGF、IL-1 β mRNA及蛋白表达均升高 （P ＜ 0.05） 。与手术组比较，手术给药组心肌组织NGF、IL-1 β mRNA表达均降低 （P ＜ 0.05） 。见表1，图1、2。

表1 3组大鼠心肌组织中NGF、IL-1 β mRNA及蛋白表达比较Tab.1 Myocardial expression of NGF，IL-1 β mRNA and protein in 3 rat groups

图1 大鼠心肌梗死周边区心肌NGF、IL-1b蛋白表达Fig.1 Myocardial expression of NGF and IL-1b protein in 3 rat groups

图2 大鼠心肌梗死周边区心肌NGF、IL-1 β mRNA表达Fig.2 Myocardial expression of NGF and IL-1 β mRNA in 3 rat groups

3 讨论

关于心肌梗死后大鼠神经重构的影响与作用机制，李军等［8］研究发现Ghrelin干预能够抑制大鼠心肌梗死后的神经增生，IL-1 β参与其中。小脑顶核刺激可以改善心肌梗死后大鼠心脏神经功能［9］。局灶性远端前壁心肌梗死改变了交感神经的局部和全局模式，导致梗死心脏激活恢复间期缩短，复极离散度增加。这些条件可能是在交感神经增强时引发心律失常机制的基础［10］。星状神经节水平对心肌损伤所致的有害神经重塑以及随后的交感神经活性增加可能是交感神经致心律失常的关键因素［11］。

本研究结果显示，大鼠心肌梗死周边心肌组织中NGF mRNA和蛋白的表达水平升高，NGF表达增高能够引起心脏交感神经过度再生。白藜芦醇能够降低梗死后心肌组织中NGF mRNA和蛋白表达水平。白藜芦醇能在小鼠急性心肌梗死后，通过SIRT1正常化/p53失活通路增强心肌基质细胞衍生因子的分泌，从而保护心脏［12］。本研究也发现大鼠心梗周边区心肌组织中的IL-1 β表达明显增加。手术给药组IL-1 β表达水平明显低于手术组 （P ＜ 0.05） 。研究［13］表明心肌梗死后IL-1 β表达迅速升高，与本研究结果一致。IL-1 β表达增加促进心肌梗死后心肌重塑，还能促进心肌中非神经细胞合成NGF［14］。白藜芦醇能够降低IL-1 β的表达，并间接减少NGF的生成，从而抑制心肌梗死后的心脏交感神经过度再生。

综上所述，白藜芦醇可减少心肌梗死大鼠心肌组织中NGF、IL-1 β蛋白和mRNA的表达，进而抑制心脏神经重塑，预防室性心律失常和心源性猝死。本研究不足之处是仅在分子水平上进行了验证，电生理方面证据缺乏，需进一步深入研究。