雌激素抑制受体型酪氨酸磷酸酯酶O促进小鼠肾足细胞增殖

任 玮，王 湘，包 瑛，高新茹

西安市儿童医院1门诊内科，3肾内科；2西安医学院病理生理教研室，陕西 西安 710003；4西北妇女儿童医院超声中心，陕西 西安 710061

肾足细胞在肾小球滤过中起至关重要的作用，是组成滤过屏障的主要成分[1]。在对奥尔波特综合征病人的研究中显示，足细胞数量和密度的减少会诱发蛋白尿，肾小球硬化症，肾功能减低等疾病[2]。雌激素影响肾脏疾病的多种生理病理功能，包括对血流动力学、系膜细胞、系膜基质、胶原代谢、细胞因子、炎症介质的释放以及肾小球滤过等多方面调节。杨霁云等研究表明，微小病变是肾病病理的常见类型，儿童发病率达到76%[3]。电镜下足细胞的足突融合是微小病变的临床特点，也是小儿肾病最常见的病理变化，发病高峰为3～4岁[3]。病重时，足细胞与肾小球基底膜分离、脱落、凋亡。因此，探讨肾足细胞凋亡的机制有助于小儿肾病综合征病理研究。但目前关于足细胞凋亡机制的研究还有不足，对肾足细胞的增殖机制还知之甚少。现有研究表明，雌激素可通过雌激素相关受体γ抑制肾小球足细胞的凋亡[4]。而本文主要研究雌激素对肾足细胞增殖的影响，并探讨其可能的影响机制，希望对小儿肾病综合征的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

小鼠肾足细胞系MPC5（上海酶研生物科技有限公司，货号：56687）；DMEM培养基（Gibco）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen）；pcDNA3.1（+）空载体（美国 Invitrogen）；小 鼠 anti-JAK1、anti-JAK2、anti-p-JAK2（Y1007）、anti-STAT3以及anti-p-STAT3（Y705）抗体（美国Abcam）；RNA提取试剂盒（美国Sigma-Aldrich，货号：RNB100-50RXN）；反转录试剂盒（MMLV）（美国Invitrogen）；PCR试剂盒（日本Takara）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad）；MTT试剂盒（中国碧云天）。

1.2 细胞培养

将MPC5细胞系置于含有10%牛胎儿血清的DMEM 培养基中，充分吹打后移入96孔板中，保持细胞密度为1×105/mL，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。每隔24 h换液1次，72 h后用于实验。

1.3 过表达载体的转染

构建酪氨酸磷酸酯酶O（PTPRO）过表达载体时，将来自正常小鼠cDNA的PTPRO片段在BamHI和EcoRI位点之间克隆至购买的pcDNA3.1（+）空白载体中，以E. coli DH5α细胞进行PTPRO的丰度表达。PTPRO引物如下：上游引物5’-gga ACC ACT GAC CTG TCC CAC TC-3’，下游引物5’-ctc GGT GTT GCT CCC TCT CTC AG-3’。采用限制性酶切和DNA测序鉴定PTPRO重组质粒。随后，通过Lipofectamine 2000介导将pcDNA3.1（+）/PTPRO和pcDNA3.1（+）质粒分别转染入MPC5细胞中，western blot 和 RT-PCR检测转染效果。ERα和ERβ过表达载体的构建同上。

1.4 Western blot

用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行总蛋白的定量。将定量后的总蛋白用10%SDS-PAGE分离，NC膜进行转膜，3%（v/v）BSA封闭45 min，孵育一抗anti-JAK1（1：1000）、anti-JAK2（1：5000）、anti-p-JAK2（Y1007）（1：1000）、anti-STAT3（1：1000）以及anti-p-STAT3（Y705）（1：2000）抗体4 ℃过夜或者37 ℃ 4 h，TBST洗3 min/次×3，孵育山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗（1：10000）1 h，TBST洗3 min/次×3，ECL发光。β-actin作为内参。采用Bio-Rad凝胶成像系统及Quantity One4.62进行条带的记录及定量。

1.5 RT-PCR

采用RNA提取试剂盒提取总RNA，取3 μL总RNA测浓度以及纯度。反转录试剂盒（M-MLV）进行cDNA第一条链的合成，PCR试剂盒进行PTPRO 目的基因扩增。选用β-actin基因为内参。采用Bio-Rad凝胶成像系统及Quantity One4.62进行条带的记录及定量。引物采用Primer6.0软件设计并由Invitrogen合成。PTPRO（mouse）NCBI序列号：NM_001164401，上游引物（5'-3'）acc act gac ctg tcc cac tc，下游引物（5'-3'）agg tgt tgc tcc ctc tct ca，产物长度172 bp，退火温度60.0 ℃。

1.6 细胞增殖检测

按照MTT细胞增殖检测试剂盒的说明书进行细胞增殖的检测，将细胞配制成单细胞悬液，以每孔1×104细胞接种于96孔板上，严格按照MTT试剂盒说明书进行操作，读取各孔的A570nm值，空白孔（只加培养液）调零，每组重复3次，结果取均值。

1.7 统计学分析

使用SPSS13.0进行统计分析，计量数据均采用均数±标准差表示，两组比较行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雌激素对小鼠肾足细胞中PTPRO的表达的影响

PTPRO的表达随17β-Estradiol（E2）剂量的增加而减少，而随E2拮抗剂tamoxifen剂量的增加而增加（P＜0.05，图1）。

图1 17β-Estradiol（E2）以及其拮抗剂tamoxifen对PTPRO的表达的影响

2.2 雌激素结合不同受体对小鼠肾足细胞中PTPRO表达的影响

图2A表示鉴定ERα和ERβ过表达载体的转染效果。当E2结合ERα时，可抑制小鼠肾足细胞中PTPRO表达（P=0.0470）；而当E2结合ERβ时，可彻底阻止小鼠肾足细胞中PTPRO表达（P=0.0232，图2）。

2.3 PTPRO对JAK/STAT信号通路的影响

PTPRO对JAK1蛋白表达没有影响（P＞0.05），可提高JAK2、p-JAK2（Y1007）、STAT3以及p-STAT3（Y705）蛋白的表达（P＜0.05，图3）。

2.4 雌激素通过抑制PTPRO表达的促进肾小球足细胞增殖

E2可抑制肾小球足细胞的生长抑制率（P＜0.05），促进其增殖。而PTPRO过表达可提高E2诱导的肾小球足细胞的生长抑制率的降低（P＜0.05，图4）。

图2 雌激素结合不同受体对PTPRO表达的影响

图3 PTPRO对JAK/STAT信号通路的影响

3 讨论

小儿肾病综合症由多种病因导致肾小球基底膜通透性增加，从而大量蛋白从尿中丢失[5-6]。足细胞附着于肾小球基底膜外侧，与血管内皮细胞和肾小球基膜一起构成肾小球血液滤过屏障[7-9]。因此，足细胞凋亡会增加肾小球基底膜通透性，诱发蛋白尿，是小儿肾病综合征的发病因素之一[8，10-11]，而足细胞增殖则可抵御小儿肾病综合征的发生。

图4 雌激素通过抑制PTPRO表达的阻止肾小球足细胞增殖

对大鼠肾包裹性高血压模型研究发现，雄性大鼠去势可减轻蛋白尿、肾小球和肾小管的损伤程度，而加用双氢睾酮则抑制该保护作用；雌性大鼠去势可加重肾小球和肾小管的损伤程度，加用17β-雌二醇则可减轻去势加重的肾脏损伤，而加用双氢睾酮则抑制该保护作用[12]。故雄激素对肾包裹性高血压诱导的肾损伤有加重作用，而雌激素对其有保护作用。与本研究相符，雌激素可促进肾小球足细胞增殖，保护肾损伤。Fung等[13]对1044例绝经后女性进行了10年的横断面观察，发现使用雌激素替代治疗组妇女血压明显低于不使用雌激素替代治疗组妇女，前者肾小球滤过率明显高于后者；10年后，前者血压明显下降，尿白蛋白/肌酐比值明显下降，而肾小球滤过率无明显变化。说明绝经后雌激素替代治疗有利于血压、肾小球滤过率和尿白蛋白/肌酐等反映慢性肾脏疾病进展指标。因此，本研究表明，雌激素对肾小球足细胞的增殖作用，可进一步降低肾小球基底膜通透性，降低蛋白尿，预防肾病综合症及小儿肾病综合征的发生。

PTPRO有6种转录变体，全长 PTPRO 在肾和脑中表达最高，在其他组织包括肝脏、乳腺等也有较高的表达[14]；研究发现，PTPRO在原发性局灶节段性肾小球硬化、严重IgA肾病以及实验性足细胞损伤导致足突过程消失等多种蛋白尿性肾病中不表达[15-17]。在分离的大鼠和兔肾小球中，采用特异性抗体封闭PTPRO可提高白蛋白的渗透性，进一步说明PTPRO在维持肾小球选择通透性中起至关重要的作用[18]。在女性子痫前期的肾损伤中，足细胞脱落，PTPRO的表达降低[19]。研究表明，雌激素-雌激素受体复合物（E2-ER）可以调节PTPRO的转录，并且ERα与ERβ在调节过程中扮演着相反的角色。与本研究结果一致，在小鼠肾足细胞中，PTPRO的表达随E2剂量的增加而减少，也即E2可抑制PTPRO的表达。尽管 ERα可促进PTPRO的转录活化，然而居于主导地位的是ERβ对PTPRO的转录抑制：结合了17βestradiol（E2）的ERβ通过作用于PTPRO启动子区域的AP-1位点，使c-jun和c-fos基因与PTPRO启动区的AP-1发生分离，从而抑制了PTPRO的转录[20]。本研究也证实了这一点，当E2结合ERα时，可抑制小鼠肾足细胞中PTPRO表达。而当E2结合ERβ时，可彻底阻止小鼠肾足细胞中PTPRO表达。表明E2与ERβ结合抑制PTPRO表达可能居于主导地位。

PTPRO可调控JAK/STAT通路的信号转导。研究表明，PTPRO基因调控JAK2的酪氨酸磷酸化过程，最终调节STAT3信号的活化。而在加入了JAK2特异性抑制剂AG490的人肝细胞肝癌细胞系中，PTPRO基因的过表达作用并没有发现调控了STAT3的特异性磷酸化位点Y705的磷酸化作用。该现象表明PTPRO介导的STAT3的Y705位点的磷酸化作用依赖于JAK2的激活[21]。本研究更加深入的直接采用肾足细胞探讨PTPRO对JAK/STAT通路的调控作用，结果表明PTPRO的过表达可提高JAK2的表达并激活JAK2，且增加STAT3的表达并激活STAT3。因此，PTPRO可激活JAK/STAT信号通路。此机制可能与雌激素促进小鼠肾足细胞增殖有关。

综上所述，雌激素可通过结合其受体ERα或者ERβ抑制小鼠肾足细胞PTPRO表达，使JAK/STAT信号通路失活，促进肾小球足细胞增殖，预防小儿肾病综合症。希望本研究可为小儿肾病综合症的预防提供新思路。