p38 MAPK信号通路在尼古丁诱导的血管内皮细胞自噬中的作用

王瑞玲　刘雯霞　刘彩红　郭蕊　王亚静

【摘要】 目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在尼古丁诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）自噬中的作用。方法：不同浓度尼古丁（6×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L）处理HUVECs，采用CCK-8和LDH试剂盒检测尼古丁对血管内皮细胞增殖和活性的影响，运用蛋白免疫印迹（Western blot）技术检测尼古丁作用下Beclin-1和LC3Ⅱ的表达及ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平。

结果：与正常对照组相比，较高浓度尼古丁（≥6×10-7 mol/L）抑制HUVECs的增殖能力（P<0.01），增加上清中LDH的活性（P<0.05），且在尼古丁浓度为6×10-6 mol/L时作用最明显。与正常对照组相比，尼古丁（6×10-6 mol/L）作用下LC3Ⅱ表達显著增加（P<0.01），而Beclin-1的表达减少（P<0.05）；同时尼古丁磷酸化MAPK信号，其中ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平分别增加了0.77倍和2.91倍（P<0.01），而JNK的磷酸化水平没有明显变化。与尼古丁组相比，SB+尼古丁组中LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达均增加（P<0.05）。结论：尼古丁可导致人脐静脉内皮细胞损伤并抑制细胞自噬，此过程中p38 MAPK信号通路可能起了重要作用。

【关键词】 人脐静脉内皮细胞； 尼古丁； 自噬； 心血管疾病； MAPK

The Role of p38 MAPK Signaling Pathway in Nicotine-induced Vascular Endothelial Cells Autophagy/WANG Ruiling，LIU Wenxia，LIU Caihong，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：0-045

【Abstract】 Objective：To investigate the differential role of mitogen-activated protein kinase（MAPK） pathway signaling in nicotine-induced vascular endothelial cells autophagy.Method：HUVECs were treated with different doses of nicotine（6×10-9，6×10-8，6×10-7，6×10-6 mol/L） .The effect of nicotine on the proliferation and activity of vascular endothelial cells was detected by CCK-8 and LDH kit.The protein expression level of Beclin-1 and LC3Ⅱand the phosphorylation of ERK1/2、p38 and JNK induced by nicotine were detected by Western blot.Result：Compared to the control group，the results indicated that higher doses of nicotine（≥6×10-7 mol/L） inhibited the ability of cell proliferation（P<0.01），and increased the activity of supernatant LDH （P<0.05），especially the 6×10-6 mol/L of nicotine had obvious effects.Compared with normal control group，nicotine（6×10-6 mol/L） significantly increased the LC3Ⅱ protein expression（P<0.01），while decreased the protein expression of Beclin-1（P<0.05）.Meanwhile，nicotine contributed to the phosphorylation of MAPK，among them，the phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPK increased by 0.77-fold and 2.91-fold（P<0.01），while the phosphorylation of JNK had no change.Compared to nicotine group， the LC3Ⅱand Beclin-1 protein expression of SB+nicotine group all increased（P<0.05）.Conclusion：Nicotine can damage human umbilical vein endothelial cells and inhibit autophagy，and p38 MAPK signaling pathway may play an important role in this process.

【Key words】 HUVECs； Nicotine； Autophagy； Cardiovascular disease； MAPK

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.010

心血管疾病死亡率居全球之首，而吸烟与心血管疾病有密切联系[1]。香烟的主要成分尼古丁，可以影响血管内皮细胞的增殖、迁移、炎症、血管再生及凋亡，从而引起血管内皮功能紊乱[2]。但是，尼古丁引起血管内皮功能紊乱的确切机制还有待进一步研究。自噬是真核生物中进化保守，降解多余、衰老或受损胞内物质的过程[3]。正常情况下很少发生自噬，但当缺血缺氧、代谢压力、蛋白质折叠错误等情况下可诱发自噬[4-6]。此外，自噬生成或降解受阻时可导致细胞功能异常甚至受损及死亡[7]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是信号从细胞表面传递到细胞内的重要传递者，目前有大量研究认为MAPK信号家族在自噬各阶段有重要作用[8-11]。据此，本实验旨在研究尼古丁对血管内皮细胞活性和自噬的影响，探讨该过程中MAPK信号家族所起的重要作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（中乔新舟，上海）；DMEM低糖培养基、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、青链霉素、Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖及毒性检测试剂盒、β-actin抗体（博士德生物，武汉）；胎牛血清（浙江天杭生物，杭州）；乳酸酶脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成生物，南京）；尼古丁（Sigma，美国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物，上海）；LC3B（Sigma，美国）；Beclin-1、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK抗体（CST，美国），辣根过氧化物酶标记二抗（中杉金桥生物，北京）；ECL发光液（爱必信生物，上海）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基培养HUVECs，置于5%CO2、37 ℃

孵箱，待细胞融合至80%进行不同浓度尼古丁（6×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L）處理24 h，6×10-6 mol/L尼古丁处理1 h或6 h，其中正常对照组不做尼古丁处理。每组处理样本数为n=3，所有实验均独立重复3次。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖 将HUVECs接种于96孔板，密度为1×105/mL，待细胞贴壁后加入不同浓度的尼古丁。按照Cell Counting Kit-8检测试剂盒说明书进行操作，孵育完成后用酶标仪在450 nm处测定各孔OD值。

1.2.3 LDH试剂盒检测细胞活性 将HUVECs以1×106/mL密度接种于6孔板，待细胞融合至80%，用不同浓度尼古丁处理后分别收集培养上清及细胞。按照乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书进行操作，之后用酶标仪在450 nm处测定各样本的OD值，并根据公式计算各组上清中LDH的活力。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 将对数生长期细胞接种于6孔板，融合至80%时分为两组：正常对照组和尼古丁组（6×10-6mol/L）（根据尼古丁对细胞增殖能力和活性影响，确定的实验尼古丁终浓度），分别给予不同处理后提取细胞总蛋白。提取细胞总蛋白具体方法：弃培养上清后置于冰上，预冷PBS冲洗3次，加入配置好的细胞裂解液，待细胞裂解后收集于离心管超声破碎及低温离心，离心完毕后抽取上清并用BCA法测定细胞总蛋白浓度，根据上样量制备蛋白样本。95 ℃，5 min蛋白变性，制备12%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离蛋白质，电泳结束后用半干转方法将蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。待封闭完成，TBST洗膜3次，每次5 min。将膜置于蛋白相对应的一抗稀释液（1︰1 000）孵育，4 ℃过夜。TBST洗膜

3次后，与一抗同源的二抗室温摇床孵育1 h。洗膜后即可用ECL发光液进行压片显影。

1.3 统计学处理 采用SPPP 18.0统计软件对所有数据进行分析处理，计量资料采用（x±s）表示。两组间比较使用t检验，多组间比较则采用单因素方差分析（one-Way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度尼古丁对HUVECs增殖能力的影响 不同浓度尼古丁处理HUVECs 24 h，尼古丁浓度≤6×10-8 mol/L时，细胞的增殖能力为（92.08±3.89）、（91.05±4.24），与正常对照组（99.00±0.87）比较，差异均无统计学意义（P=0.292、0.121）；当尼古丁浓度≥6×10-7 mol/L

时，细胞的增殖能力减弱，分别为（65.35±6.68）、（61.26±1.98），与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P=0.000 0、0.000 0），且呈尼古丁剂量抑制依赖性关系，见图1。

2.2 不同浓度尼古丁对HUVECs中LDH活力的影响 不同浓度尼古丁处理HUVECs 24 h，尼古丁浓度≤6×10-8 mol/L时，上清中LDH活力分别为（9.92±1.52）、（10.51±1.10），与正常对照组（8.82±0.83）相比，差异均无统计学意义（P=0.207、0.082）；当尼古丁浓度≥6×10-7 mol/L时，上清中LDH活力呈尼古丁浓度依赖性增加，分别为（13.70±1.20）、（15.50±0.71），与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P=0.000 0、0.000 0），见图2。

2.3 尼古丁抑制HUVECs自噬 浓度为6×10-6 mol/L的尼古丁干预细胞6 h，与正常对照组相比，尼古丁组LC3Ⅱ蛋白表达增加了1.41倍（1.33±0.12 vs 0.47±0.12，t=8.489，P=0.001），而此时Beclin-1蛋白表达却减少了0.73倍（0.19±0.06 vs 0.33±0.02，t=4.013，P=0.016），见图3。

2.4 尼古丁诱导MAPK磷酸化 与正常对照组相比，尼古丁处理1 h后MAPK信号家族成员中，ERK1/2、p38磷酸化水平均增加，差异均有统计学意义（P<0.01）；而JNK的磷酸化水平并无明显变化。其中，尼古丁组ERK1/2磷酸化水平（1.63±0.08）与对照组（0.92±0.11）相比增加了0.77倍（t=8.828，P=0.0009）；而尼古丁组p38 MAPK的磷酸化水平（2.42±0.16）与对照组（0.62±0.11）相比增加了2.91倍（t=17.96，P=0.000 1）。见图4。

2.5 p38 MAPK抑制自噬的生成 p38 MAPK抑制剂SB203580预处理HUVECs 30 min后给予尼古丁处理6 h。与尼古丁组LC3Ⅱ蛋白表达（1.33±0.12）相比，SB+尼古丁组LC3Ⅱ蛋白表达进一步增加（1.65±0.10）（P=0.014）；与尼古丁组Beclin-1蛋白表达（0.11±0.03）相比，SB+尼古丁组的Beclin-1蛋白表达也进一步增加（0.27±0.01）（P=0.007）。见图5。

3 讨论

吸烟是心血管疾病发生发展的主要危险因素。香烟的主要成分尼古丁可以促进心血管疾病发生[12-14]。尼古丁通过多种机制增加炎症因子释放、黏附分子的表达，导致内皮细胞功能紊乱[15]；此外尼古丁还可以通过激活肥大细胞促进动脉粥样硬化疾病的进展[16]，但是确切机制还不清楚。本实验旨在通过离体实验用尼古丁干预正常HUVECs，证实尼古丁作用下HUVECs增殖能力减弱且细胞膜受损，同时细胞自噬的生成受到抑制，而在该过程中p38 MAPK信号具有重要作用。

心血管疾病是由吸烟、高血压等多种因素引起的一系列继发性缺血性改变，而尼古丁可通过紊乱内皮细胞功能从而促进心血管疾病的发展[17]。已有多项研究表明，尼古丁可促进内皮细胞增殖、存活及增加细胞自噬[18]，而还有研究认为尼古丁对内皮细胞有毒性作用从而促进细胞死亡[19]。这些争议存在的原因可能是由于实验所用尼古丁浓度不同导致的。据此，本实验采用不同浓度的尼古丁（6×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L）处理HUVECs，检测尼古丁作用下细胞的增殖能力与损伤程度，以确定实验所用尼古丁终浓度。本研究发现，6×10-9、6×10-8 mol/L尼古丁浓度组内皮细胞的增殖能力和培养上清LDH活性与正常对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）；而尼古丁浓度为6×10-7、6×10-6 mol/L时两个指标都发生了明显变化，且呈尼古丁浓度依赖性。这提示较高浓度的尼古丁可抑制血管内皮细胞增殖，破坏细胞膜的完整性，促进细胞损伤。之前有报道发现尼古丁浓度低于

10-8 mol/L时可促进细胞增殖和存活，而高浓度尼古丁（>10-6 mol/L）则对内皮细胞有损伤和毒性作用[20]，这与本实验研究结果相一致。因此，为了研究尼古丁对血管内皮细胞增殖抑制和损伤的机制，选用高浓度尼古丁（6×10-6 mol/L）做进一步研究。

自噬（大自噬）过程主要包括自噬的生成和降解两个阶段：即自噬小体的形成与自噬小體和溶酶体融合降解。Beclin-1是哺乳动物诱导自噬生成起始的基因，微管相关蛋白1轻链3（LC3Ⅱ）则是自噬小体标志物。本实验中，尼古丁作用下Beclin-1蛋白表达减少，提示尼古丁作用下血管内皮细胞自噬生成水平下降；而LC3Ⅱ表达增多，这与自噬生成减少相矛盾，提示尼古丁还可能影响自噬的降解过程。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）主要分为3个亚族：ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路是多种信号通路的中心，参与细胞生长、发育、分裂、凋亡等多种生理反应过程[21]。近年来越来越多的研究发现，MAPK信号家族在自噬的调控过程中有重要作用[8-11]，比如不同细胞类型和细胞内环境条件下，p38 MAPK对自噬有促进或抑制作用[11，22]。本实验中，尼古丁作用下并没有发现JNK的磷酸化，而ERK1/2和p38 MAPK磷酸化增多，且p38 MAPK磷酸化水平增加更显著。使用p38 MAPK抑制剂SB203580后可逆转尼古丁作用下Beclin-1蛋白表达的减少，而此时LC3Ⅱ可能由于Beclin-1生成增多而增加。这提示MAPK家族成员p38 MAPK在尼古丁引起的自噬生成抑制环节中起重要作用，但是可能并不直接参与自噬的降解过程。此外，自噬的生成是否还与其他信号通路有关，以及自噬小体标志物LC3Ⅱ蛋白增多的原因还有待进一步探究。

综上所述，本实验初步研究了尼古丁对血管内皮细胞增殖、活性及自噬的影响，且探讨了MAPK在该过程中的作用，揭示了p38 MAPK在尼古丁引起的自噬生成抑制中有重要作用，而自噬生成抑制可能是细胞受损的原因之一。总之，本研究从机制方面为尼古丁引起的心血管疾病的治疗提供了新思路。

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（收稿日期：2018-03-26） （本文編辑：张爽）