DEAR1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

蒋烈浩　谭卓　殷珂欣　黄煜庆　温庆良　朱欣　葛明华

【摘要】 目的：初步探讨DEAR1蛋白在甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中的表达情况及其临床意义。方法：采用免疫组化检测60例甲状腺乳头状癌组织及对应癌旁组织中DEAR1蛋白的表达情况，分析DEAR1表达与临床病理因素之间的相关性。结果：DEAR1蛋白在PTC组织中表达量显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.01）。DEAR1蛋白低表达与PTC肿瘤直径较大、包膜侵犯和颈部淋巴结转移密切相关（ρ=-0.367、-0.436、-0.406，P=0.004、0.002、0.001），而与性别、年龄、腺内播散、砂粒体、肿瘤数量组均无明显相关性（P>0.05）。结论：DEAR1蛋白表达缺失与PTC的发生、发展可能存在密切联系，且在PTC增殖、包膜侵犯和颈部淋巴结转移中可能发挥着一定的作用。

【关键词】 DEAR1蛋白； 甲状腺乳头状癌； 免疫组化； 侵袭； 转移

Expression and Clinical Significance of DEAR1 Protein in Papillary Thyroid Carcinoma/JIANG Liehao，TAN Zhuo，YIN Kexin，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：005-009

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of DEAR1 in papillary thyroid carcinoma（PTC）and its para-carcinoma tissues and evaluate the association between DEAR1 expression and clinicopathologic factors.Method：Immunohistochemistry was used to evaluate the expression of DEAR1 in 60 cases of PTC and para-carcinoma tissues and the relationship between DEAR1 expression and clinicopathologic factors were analyzed.Result：The expression of DEAR1 was significantly down-regulated in PTC tissues compared to para-carcinoma tissues （P<0.01）.The expression of DEAR1 was significantly associated with tumor size，Capsular invasion and Lymph node metastasis（ρ=-0.367，-0.436，-0.406，P=0.004，0.002，0.001），while no significant relationship were found between the expression of DEAR1 and gender，age，lobe dissemination，psammoma body and tumor number（P>0.05）.Conclusion：The low expression of DEAR1 may relate to the development of PTC，and it may play an important role in proliferation，capsular invasion and Lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.

【Key words】 DEAR1 protein； Papillary thyroid carcinoma； Immunohistochemistry； Invasion； Metastasis

First-authors address：Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.002

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，近年来甲状腺癌的发病率快速上升，已被列入恶性肿瘤的前10位[1]。根据2016年美国国家癌症署数据显示，全世界新发的甲状腺癌以平均每年大于5%的速度递增，其中增长最快的是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[2]。雖然绝大多数PTC预后优异，10年生存率可达90%以上，但约有50%的患者在发现时已经存在颈部淋巴结转移，有10%～20%的病例会出现反复发作及远处转移，一旦发生远处转移，10年生存率降至40%左右[3]。目前，临床上对于PTC的主要治疗方式是手术切除，放化疗基本无效[4]。但是，近几年来学术界对于PTC是否需要手术一直存在争议，部分专家认为PTC恶性程度低，进展缓慢，对于直径小于1 cm的PTC可暂时予以随访观察[5]。而另一部分支持手术的专家则认为微小癌不一定等于低危癌，在临床中很多微小癌患者的进展非常快，在早期就出现局部或远处转移，故而在目前缺乏有效鉴别手段的情况下，PTC的早诊早治还是十分有必要的。但是，目前导致PTC发病和进展的详细分子机制仍未被完全阐明。因此研究高危型PTC的重要分子事件，筛选用于表征高危型PTC恶性演进及转移相关的分子标志物，进而早期从众多PTC患者中鉴别出高危型患者，实现有效早期诊断和预后预测，对患者进行分层治疗，具有重要的理论意义和临床应用价值。

DEAR1（ductal epithelium-associated ring chromosome 1）基因位于1号染色体p35.1，有研究表明该区域的杂合性缺失可能与乳腺癌等多种上皮恶性肿瘤密切相关[6]。近年来，已有报道显示DEAR1可以显著地影响肿瘤细胞的极性及细胞骨架结构，在乳腺癌、肺癌、急性髓细胞性白血病等多种恶性肿瘤中发挥着抑癌基因的作用[7-9]。但DEAR1在PTC中的作用尚未见报道。本研究拟通过免疫组化方法检测PTC组织中DEAR1蛋白的表达情况，进一步探讨DEAR1与PTC临床病理因素相关性。希望能初步阐明DEAR1基因在PTC发生发展及侵袭转移中的作用，以期为今后高危型PTC患者的筛查和危险分层诊治提供一定的分子研究基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究入组60例2014年11月-2015年1月在本院首诊的PTC患者，收集其甲状腺乳头状癌及对应癌旁组织标本。本研究经浙江省肿瘤医院伦理审核批准，所有患者术前均签署知情同意，术后均经病理诊断确诊为甲状腺乳头状癌。所有组织标本在手术切除离体后立即由专业生物样本库人员切取并置入液氮冷冻，后转入-80 ℃低温冰箱保存。本研究所有患者病例资料完整，术前均未行放化疗及其他特殊治疗。本研究排除有其他并发恶性肿瘤，或有严重肝、肾、心血管功能障碍及严重并发症的病例。

1.2 试剂 DAB显色试剂盒（中国索莱宝科技有限公司）；改良型苏木素染色液（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Anti-DEAR1抗体（英国Abcam公司），HRP标记羊抗兔二抗（免疫组化用）（英国Abcam公司）；一抗稀释液（中国碧云天有限公司）；二抗稀释液（中国碧云天有限公司）；柠檬酸钠（中国致远化学试剂有限公司）；PBS缓冲液（中国飞净生物科技有限公司）；甲醛（中国常州恒光化学试剂有限公司）；无水乙醇（中国常州恒光化学试剂有限公司）；二甲苯（中国常州恒光化学试剂有限公司）；过氧化氢溶液（中国常州恒光化学试剂有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法 用甲醛固定所有手术标本，石蜡常规包埋，5 μm切片。乙醇梯度脱蜡、水化后将切片浸没于柠檬酸钠缓冲液中，微波抗原修复，每张切片滴2滴5%过氧化氢溶液，静置5 min以清除内源性过氧化物酶，加上适宜浓度（1︰200）的DEAR1一抗稀释溶液100 μL，室温孵育1 h。蒸馏水及PBS液冲洗后，加适宜浓度（1︰1 000）HRP标记羊抗兔二抗稀释溶液100 μL，湿盒孵育

30 min。常规DAB显色、苏木素复染、促蓝、乙醇梯度脱水后封片。

1.3.2 读片打分 将切片置于显微镜（×400）下拍照，每张切片选取5个清晰、不重复、典型部位，若细胞核、细胞浆及细胞膜任何一处出现棕黄色颗粒时，评定为阳性细胞，评分标准采用半定量分析法：染色强度以多数细胞呈现的染色特性（染色深浅需与背景着色相对比）计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比即某类细胞5个视野（每×400高倍视野计数100个此类细胞）的阳性细胞平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。所取每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分，染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0分为阴性（-），1～4分為弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。所有的切片都经3名有经验的病理科医生独立阅片，本研究定义最终得分≤4分为阴性，>4分为阳性。

1.4 观察指标 完整搜集入组的60例患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、包膜累犯情况、淋巴结转移情况、腺内传播情况、有无沙粒体等基本临床病理信息，结合DEAR1在组织样本中的表达情况，分析其与上述临床病理特征之间的相关性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验或Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测甲状腺乳头状癌及癌旁组织中DEAR1蛋白表达情况 通过对所有样本进行免疫组化检测，发现DEAR1蛋白在甲状腺乳头状癌组织中低表达，而在癌旁组织中高表达，统计结果显示，甲状腺乳头状癌组织中DEAR1蛋白阴性33例，阳性27例，癌旁组织中阴性4例，阳性56例，甲状腺乳头状癌组织中表达量阴性显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（字2=32.862，P=0.000）。

2.2 DEAR1蛋白表达水平与PTC临床病理特征之间的关系 结合60例PTC患者的临床病理特征，进一步分析DEAR1蛋白表达水平与PTC临床病理特征之间的相关性。结果显示：（1）在PTC直径>1 cm组织中DEAR1蛋白阳性率为13.33%（2/15）明显低于直径≤1 cm组织，差异有统计学意义（P<0.05）；（2）伴包膜侵犯的PTC组织中DEAR1蛋白阳性率明显低于无包膜侵犯的PTC组织，差异有统计学意义（P<0.05）；（3）伴淋巴结转移的PTC组织中DEAR1蛋白阳性率明显低于无包膜侵犯的PTC组织，差异有统计学意义（P<0.05）；而不同性别、年龄、腺叶有无播散、有无砂粒体、肿瘤数量的DEAR1蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。（4）Spearman相关性分析结果显示：DEAR1蛋白低表达与PTC肿瘤直径较大、包膜侵犯和颈部淋巴结转移密切相关

（ρ=-0.367、-0.436、-0.406，P=0.004、0.002、0.001），而与性别、年龄、腺内播散、砂粒体、肿瘤数量均无明显相关性（P>0.05）。

3 讨论

近年来，PTC发病率在全球急速上升，虽然绝大多数PTC预后较良好，但仍有一部分患者早期便出现局部侵犯或远处转移，这也导致学术界对于PTC是否需要早期手术一直存在争议[2，10]。目前已有部分报道显示BRAF、TERT、PTEN、RunX2、S100A4、RAS、AKT1、ALK、RET、PAX8/PPARγ、galectin3等基因在PTC的局部侵犯、淋巴结转移甚至远处转移的过程中发挥着一定的作用[11-14]。BRAFV600E突变一度被认为是PTC中最经典的基因突变，与PTC的淋巴结转移、复发以及对腺外组织的侵犯有一定的相关性[15]。虽然其中的部分标记物曾被尝试用于甲状腺癌的辅助诊断，但至今仍无有效突破，能真正用于临床检测的分子标志物仍然十分缺乏，使得目前在术前对PTC患者进行危险分层诊治仍然存在较大的困难。故而积极寻求甲状腺乳头状癌的特异性标志物，对于PTC的早期诊疗及预后判断意义重大。

DEAR1（TRIM62）蛋白是TRIM（Tripartite Motif）家族的一员，内具RING、B-box、Coiled-Coiled三个结构域，在蛋白复合体组装、空间结构维持及部分蛋白质的泛素化降解过程中都发挥着重要的作用。近年来，DEAR1被发现在正常上皮细胞中高表达，在乳腺癌、肺癌、肾癌等多种恶性肿瘤中存在突变及表达减少[7-9，16]。研究发现在K-Ras突变的肺癌小鼠模型中敲除DEAR1，能协同K-Ras突变，共同促进肿瘤的发生和转移，该结果表明DEAR1表达下调可能在肺癌的进展中发挥着重要作用[7]。文献[8]报道显示，DEAR1在急性髓细胞性白血病肿瘤细胞中的表达量明显低于正常对照细胞，DEAR1表达缺失可能参与了白血病的发生，且是急性髓细胞性白血病预后不良的独立危险因素。在乳腺癌细胞系中稳定转入野生型DEAR1表达后，在3D培养模型中可以观察到规则的乳腺腺泡重建，细胞极性恢复；相反，如果沉默DEAR1表达会发现细胞极性消失，腺泡结构紊乱，甚至消失[9]，这表明DEAR1在乳腺癌中可以通过调节细胞极性，进而发挥肿瘤抑制作用。以上研究表明DEAR1可能通过影响肿瘤细胞的极性及细胞骨架结构，进而调节肿瘤组织结构，在肿瘤中发挥着抑癌基因的作用[7]。

目前已有研究显示细胞极性的丧失能够与其他致癌信号通路协同作用，诱导上皮细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促进肿瘤的侵袭和转移[17-19]。EMT过程已经被证实在乳腺癌、胃癌等多种上皮性恶性腫瘤的浸润和转移中发挥着重要作用，且该过程可能受TGF-β信号通路的调节[20]。目前，已有研究显示DEAR1在TGF-β信号通路的调节中发挥着重要作用，在乳腺癌中野生型DEAR1表达可诱导SMAD3被泛素化降解，进而使TGF-β诱导的EMT过程被抑制；反之，敲除DEAR1表达后将导致SMAD3表达上调，进而激活TGF-β诱导的磷酸化和核翻译，并促进EMT过程[6]。这表明DEAR1可能通过抑制TGF-β信号通路来发挥其肿瘤抑制基因的作用。

本实验以前期的研究成果为基础，已成功筛选出甲状腺乳头状癌转移相关的差异基因表达谱，采用生物信息方法，结合免疫组化方法确定了DEAR1为候选研究对象，目前为止，关于DEAR1基因在甲状腺癌中的具体生物学功能尚未见报道。

本研究主要通过免疫组化法检测了DEAR1蛋白在60例PTC及癌旁组织中的表达情况，并进一步分析了DEAR1蛋白的表达水平与PTC临床病理因素之间的相关性。结果显示：DEAR1蛋白在PTC组织中的表达量显著低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.01）。继而通过与上述标本临床病理数据统计分析发现，DEAR1蛋白的表达水平与肿瘤大小、包膜侵犯及淋巴结转移密切相关（P<0.01），而与性别、年龄、有无腺内播散、有无砂粒体、肿瘤数量无明显相关性（P>0.05）。这一结果提示DEAR1基因表达缺失可能在PTC的发生发展、局部侵犯及转移过程中发挥着重要作用。但目前为止笔者仅仅研究了DEAR1在PTC肿瘤组织及其对应的癌旁正常组织中的表达情况及其与各临床病理因素之间的相关性，其抑制PTC侵袭转移的相关分子机制实验正在研究中，将在后续报道中继续完善。

综上所述，DEAR1基因表达缺失在PTC发生发展的过程中可能发挥着一定的作用，且与PTC的肿瘤大小、包膜侵犯及淋巴结转移密切相关。因此，DEAR1基因将来可能为PTC高危患者的早期筛查、诊治提供新的分子标记物或药物干预靶点，并有望为PTC患者的分层诊断及精准治疗奠定一定的理论基础与实验依据。

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（收稿日期：2018-04-08） （本文編辑：张爽）