除湿通痹方对大鼠急性痛风性关节炎模型抗炎作用机制研究

昆明市中医医院，云南 昆明 650011

痛风性关节炎是尿酸钠在关节腔内形成微晶体沉淀后引起的非特异性关节炎症[1]，以关节的红、肿、热、痛为重要表现[2]，甚至出现关节变形，严重影响患者生活质量[3]。除湿通痹方是在中医基础理论指导下，结合临床应用总结而来，有较好的抗炎、镇痛作用。本实验观察除湿通痹方对急性痛风性关节炎模型大鼠炎症程度、IL-1β、IL-1R影响。

1 材料

1.1 动物 清洁级，SD大鼠72只，雌雄各半，购于购于四川省医学科学院实验动物研究所。生产许可证号：SCXK(川)2008-24，合格证号：0002777。饲养于云南中医学院动物房，180～200 g，自由活动、进食。

1.2 药物 秋水仙碱(规格：50 mg/片，批号：H53021369，西双版纳药业有限公司)。除湿通痹方由昆明市中医医院制剂室提供(由王不留行、萆薢、荆芥、防风、川芎、羌活、元胡、牛膝、茯苓等组成，煎煮浓缩至2 g/mL)。

1.3 试剂 抗IL-1β抗原(西陇化工股份有限公司 33535)；PBS(索莱宝科技有限公司；P1010)；大鼠免疫组化试剂盒(索莱宝科技有限公司；G8590)等。

1.4 仪器 电子分析天平；显微镜；DECTA320 pH计；GB2292型套式恒温器；振荡混合器；离心机等。

2 方法

2.1 尿酸钠结晶及尿酸钠溶液的制备[6]将800 mg尿酸钠和155 mL生理盐水混合，加热尿酸钠溶解。滴入1 mol/L的盐酸，调整pH 6.8～7.2。离心至晶体不再析出，置于4℃冰箱保存备用。

2.2 除湿通痹方制备 将王不留行、元胡、牛膝、萆薢、羌活等中药按剂量比列放置在套式恒温器中，武火煮沸后改文火煎煮，浓缩药液至2 g/mL 。

2.3 动物模型的制备 采用 Coderre方法[7]造模。水合氯醛麻醉、消毒，将尿酸钠溶液 (50 mg/mL)注入踝关节腔，复制急性痛风性关节炎模型。

2.4 分组及给药 SD大鼠72只，随机分为6组，分为空白组、模型组[4 mL/(kg·d)]、秋水仙碱组[0.0012 g/(kg·d)]为阳性组,除湿通痹方低剂量组[9 g/(kg·d)]、中剂量组[18 g/(kg·d)]、高剂量组[36 g/(kg·d)]。除空白组外，余5组大鼠复制大鼠急性痛风性关节炎模型。造模后2 h后开始灌胃，连续灌胃7d，处死大鼠取材[8]。

2.5 观察指标

2.5.1 大鼠关节肿胀度 每只鼠注射尿酸钠(MSU)晶体溶液前及注射MSU晶体溶液2 h左后足容积。足跖肿胀度为注射MSU前后大鼠左后足容积之差。

2.5.2 关节软组织内炎症细胞计数(淋巴细胞、巨噬细胞) 第7d灌胃3 h后麻醉处死大鼠，取左踝关节软组织。常规甲醛液固定、脱钙、脱水、透明、浸蜡，包埋，切片4 m，苏木精一伊红染色。用Image Pro-Plus 6.0行图像分析。

2.5.3 关节软组织内IL-1β、IL-1R 石蜡切片常规脱蜡，过氧化氢去内源性酶，胰酶消化暴露抗原，滴加一抗，4℃孵育过夜，滴加生物素标记二抗、酶标记链霉卵白素过氧化物酶，联苯二胺 (DAB) 显色。

2.6 统计方法 用Image Pro-Plus 6.0行图像分析后采用 SPSS 18.0统计软件进行统计分析，以P<0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠左足跖肿胀度的比较 由表1可知，造模后第3d，与模型组比较，各给药组差异无统计学意义；造模后第7d，与模型组比较，各给药组足肿胀度均显著降低 (P<0.01)；除高剂量组与阳性组比较差异有统计学意义 (P<0.05)。

表1 各组大鼠左足趾肿胀度的比较

2.2 各组大鼠关节软组织切片中单位面积炎症细胞计数比较 由表1可知，与空白组比较，其余各组的关节切面中均产生大量淋巴细胞及巨噬细胞(P<0.01)；与模型组比较，各给药组差异均有高度统计学意义(P<0.01)；其中淋巴细胞计数阳性组与除高组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组大鼠关节软组织中 IL-β、IL-1R 表达的比较 由表3可知，与空白组比较，模型组、阳性组、除湿通痹方各剂量组的 IL-β、IL-1R平均光密度值均升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组平均光密度值显著降低(P<0.05)； 阳性组与除中、低组比较差异无统计学意义(P>0.05)，此三组与除高组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠关节软组织中单位面积炎症细胞计数比较 (个

表3 各组大鼠IL-1β、IL-1R平均光密度值的比较

4 讨论

急性痛风性关节炎属中医“痹证”范畴，脏腑失职、脾虚不运；脏腑阳盛积热，日久成病[9]；急性期当以“通”为治则，通湿、除痰、化瘀，以“通”止痛，“通则不痛”[9]，由此组方为除湿通痹方。方中王不留行消肿止痛；萆薢祛风除痹，川木通通利关节；茯苓、泽泻泄肾浊；桔梗利五脏，荆芥、防风胜湿止痛，止痉定搐；牛膝通经除痹[9]。诸药合用有益气补脾肾、祛湿、降浊、通窍作用[9]。

实验通过比较大鼠左足趾肿胀程度及软骨组织中炎症细胞数量，来观察除湿通痹方是否具有消炎、抗肿的功效。且IL-1是炎症级联放大效应的关键环节，主要以IL-1β形式存在关节内，是炎症调节的始动因素[10-12]。因此抑制IL-1β是防治痛风性关节炎的有效途径。结果显示：各给药组平均光密度值显著低于模型组(P<0.05)；阳性组、除低组、除中组与除高组比较，差异显著(P<0.05)。说明各给药组对IL-1β、IL-1R的表达有抑制作用，其中，除湿通痹方高剂量组抑制作用较除湿通痹方低剂量组、中剂量组强。本研究结果为除湿通痹方治疗急性痛风性关节炎提供了实验依据，为中医药治疗急性痛风性关节炎提供实验数据。除湿通痹方可用于急性痛风性关节炎的治疗,其作用机制可能与阻断关节软组织内IL-1β和IL-lR的表达有关。