THBS1表达上调对肺腺癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

王晓慧，刁长英，谢艺林，刘亚清，高献争，韩 静，李晟磊，刘红涛

1)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052 2)郑州大学生命科学院细胞生物学研究室 郑州 450001

肺癌是全世界癌症死亡的首要原因[1]。肺癌中非小细胞癌进展快、侵袭力强、死亡率高。目前非小细胞肺癌分子机制和治疗的研究已经成为现阶段医学研究的热点。血小板凝血酶蛋白家族(thrombospondin，THBS)是最初发现于血小板中的糖蛋白，但也可以由许多正常和转化的细胞合成和分泌。THBS1 是该家族中第一个被确定的成员，是一种相对分子质量大约为450 000的三聚体同源复合物，能够介导细胞与细胞、细胞与基质之间的作用，并参与调节肿瘤的进展与转移[2]。有研究[3-4]提出THBS1在肿瘤增殖、侵袭中具有重要作用，其异常表达可能与肿瘤的生长关系密切。我们通过构建 THBS1真核表达载体，以脂质体法转染入肺腺癌细胞，观察癌细胞中THBS1表达的变化及其对肺腺癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株与主要试剂肺腺癌细胞株A549、H1299、H358、H1975、PC9、PG49和Calu3均从美国ATCC购买，均培养在RPMI 1640培养基中，并补充体积分数10%的胎牛血清。RPMI 1640和胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol 试剂购自北京雷根生物技术有限公司；pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司；T4 DNA连接酶购自美国NEB公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；反转录试剂盒ReverTra Ace Qpcr RT Master mix 购自日本TOYOBO公司；SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus)购自日本TaKaRa公司；PCR产物纯化试剂盒、HindⅢ和XbaⅠ购自大连宝生物科技有限公司；DH5α感受态细菌、质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；BSA和DMSO购自美国Sigma公司；CCK-8试剂购自中国碧云天生物科技有限公司。

1.2肺腺癌细胞中THBS1mRNA的检测采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测。按照Trizol试剂说明提取肺腺癌细胞总RNA，用微量紫外分光光度计测量RNA浓度，并判定其纯度。用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明进行扩增，反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，严格按照试剂盒说明书进行结果判读。采用2-ΔΔCt法计算THBS1 mRNA表达量。

1.3pcDNA3.1-THBS1真核表达载体的构建扩增A549细胞DNA，按回收试剂盒操作说明回收特异PCR产物。采用HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1空载体，电泳后胶回收酶切产物目的片段，连接酶连接目的片段后转化大肠杆菌DH5α，提取质粒并进行PCR、测序鉴定，鉴定正确者即为pcDNA3.1-THBS1。

1.4转染pcDNA3.1-THBS1对肺腺癌细胞H1975增殖、凋亡和细胞周期的影响

1.4.1 实验分组 将H1975细胞接种至25 cm2的培养瓶中，并加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，待细胞生长状态良好，用胰蛋白酶消化，接种至6孔板中。实验设3组。空白对照组不做处理；pcDNA3.1组和pcDNA-THBS1组细胞按照LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)操作说明分别转染空载体pcDNA3.1和pcDNA-THBS1。

1.4.2 细胞中THBS1 mRNA的检测 转染48 h后采用qRT-PCR法检测细胞中THBS1 mRNA的表达，方法同1.2。每组3个复孔。

1.4.3 细胞增殖检测 转染48 h后，将3组细胞分别接种至96孔板中，常规培养24、48、72和96 h后，加入CCK-8试剂2 h，然后在酶标仪上测定450 nm处的吸光度值。每组均3个复孔。

1.4.4 细胞凋亡检测 转染48 h后收获3组细胞，调整细胞密度为5×106个/mL，取500 μL用PBS漂洗，重悬，避光保存，2 000 r/min 离心5 min，PBS漂洗，加入荧光溶液(SA-FLOUS)1 h后悬浮，上流式细胞仪检测。每组均3个复孔。

1.4.5 细胞周期分布 3组细胞培养48 h，2 000 r/min离心5 min，调整细胞密度为1×106个/mL，胰蛋白酶充分消化，离心弃上清，漂洗后离心，加入体积分数70 %冰乙醇孵育，离心去乙醇并漂洗，用含RNA酶A的PBS缓冲液重新悬浮细胞，加入碘化丙锭1 mL并避光放置30 min，最后上流式细胞仪检测分析细胞。每组均3个复孔。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较7株肺腺癌细胞中THBS1 mRNA表达量，3组THBS1 mRNA表达量、吸光度、细胞凋亡率和细胞周期；两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同肺腺癌细胞中THBS1mRNA的表达见表1。肺腺癌细胞A549、PC9和Calu3中THBS1 mRNA表达量较高，其中PC9细胞中表达量最高；而H1299、H358、H1975和PG49细胞中THBS1 mRNA表达量较低，其中H1975细胞表达量最低。

表1 不同肺腺癌细胞中THBS1 mRNA的表达量

7组比较，F=104.148，P<0.001；*：与A549细胞相比，P<0.05

2.2pcDNA-THBS1真核表达载体的鉴定从A549细胞中成功扩增出THBS1基因，其大小约为3 500 bp(图1)。从重组质粒pcDNA-THBS1中扩增出500 bp左右的目的片段(图1)。测序结果表明成功构建了pcDNA-THBS1真核表达载体。

1和3：Marker；2：THBS1的PCR产物；4：pcDNA-THBS1的PCR产物

图1pcDNA-THBS1的鉴定

2.3转染pcDNA3.1-THBS1后肺腺癌细胞H1975增殖、凋亡和细胞周期的变化

2.3.1 3组细胞中THBS1 mRNA表达量的比较 见表2。

2.3.2 3组细胞增殖能力的比较 见表2。与空白对照组和pcDNA3.1组相比，pcDNA-THBS1组细胞增殖能力显著增强。

2.3.3 3组细胞凋亡率的比较 见表3。pcDNA-THBS1组早期细胞凋亡率和总凋亡率低于空白对照组和pcDNA3.1组。

2.3.4 3组细胞周期分布的比较 见表4。 pcDNA-THBS1组G0/G1期细胞比例低于空白对照组和pcDNA3.1组，S期细胞比例大于空白对照组和pcDNA3.1组；3组G2/M期细胞比例差异无统计学差异；提示THBS1表达上调能促进细胞周期进程。

表2 3组细胞中THBS1 mRNA表达量及吸光度的比较

*：与空白对照组相比，P<0.05；#table_note.1组相比，P<0.05

表3 3组细胞凋亡率的比较 %

*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与pcDNA3.1转染组相比，P<0.05

表4 3组细胞周期的比较 %

*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与pcDNA3.1转染组相比，P<0.05

3 讨论

THBS是广泛分布于多种组织细胞及细胞外基质中的分泌性钙结合糖蛋白，包括THBS1至THBS5共5个成员[5]。THBS呈多模块结构，每个区域通过特异性结合不同的因子而发挥不同的功能，高分辨率测定显示出其独特而有趣的蛋白结构。根据分子结构THBS可分为两组，其中THBS1和THBS2含有Ⅰ型重复序列TSRs(A组)，其他成员不含有该序列(B组)[6]。TSRs也称为裂解素重复序列，功能涉及细胞附着、血管生成的抑制、蛋白质-蛋白质和蛋白质-黏多糖的相互作用[7]。因此THBS1能够调节血管内皮细胞的黏附、迁移与增殖，以及新生血管形成；B组成员缺乏TSRs序列，因此在肿瘤微环境中不具有抗血管生成作用[5]。

目前人们意识到THBS1不仅仅在血小板聚合和凝固中的发挥作用[8-9]，THBS1还可影响肿瘤进展；早期阶段(休眠)基质细胞表达高水平的THBS1，可抑制新生血管形成和肿瘤的生长，晚期阶段则促血管因素增加，促进肿瘤生长及侵袭[4,10-13]。

作者利用qRT-PCR检测发现不同肺腺癌细胞中THBS1 mRNA的表达量不同。研究[14-16]证实前列腺癌、胰腺导管腺癌等肿瘤中THBS1表达下降，而食管鳞状细胞癌等肿瘤中THBS1表达升高。本研究证实即使在同一种肿瘤的不同细胞系中，THBS1的表达水平也有所不同，这能更好地解释不同类型肿瘤中THBS1差异表达的问题。作者构建了pcDNA3.1-THBS1真核表达载体并利用脂质体转染入THBS1表达最低的H1975细胞株，细胞中THBS1 mRNA表达明显上调，而上调细胞中的THBS1表达可以增强H1975细胞的增殖，抑制其凋亡并促进细胞周期进程。本研究结果提示THBS1可能与肺腺癌的发生发展密切相关，这为THBS1作为肺腺癌靶向治疗目标的研究奠定了基础。