嵌合抗原受体T细胞治疗实体瘤的现状和挑战

张 毅，刘艳粉

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心和肿瘤中心 郑州 450052 2)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell ,CAR-T)在CD19+B细胞血液系统恶性肿瘤中取得了惊人的疗效，美国食品及药物管理局和欧盟均已批准Kymriah(Tisagenlecleucel,曾用名为CTL019)用于治疗急性淋巴细胞白血病(<25岁)和弥漫大B细胞淋巴瘤。CAR-T在血液系统恶性肿瘤的成功应用进一步促进了CAR-T在实体瘤中应用的研究，多项CAR-T治疗实体瘤的临床前研究和临床研究正在开展。CAR-T虽然在某些实体瘤取得了一定的疗效，然而，其疗效并不像在血液系统恶性肿瘤中那样令人满意。至今，CAR-T治疗实体瘤仍然存在诸多亟需解决的问题，如靶点的选择、克服肿瘤免疫抑制微环境以及联合治疗等。本文主要介绍CAR-T治疗实体瘤的研究现状及所面临的挑战。

1 CAR-T治疗实体瘤的现状

1989年Gross等[1]提出嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的概念，至今已发展至第4代CAR。目前应用较多的是第2代CAR，其由胞外的单链可变区、跨膜区和胞内的信号区3部分组成。第3代CAR胞内部分有2个共刺激信号。第4代CAR是在第2代CAR的基础上加入某些可增强T细胞功能的基因(如细胞因子基因)。CAR-T无主要组织相容性复合体限制性，且在体内可以增殖，较普通T细胞具有更强的增殖能力及杀伤肿瘤能力。靶向CD19的CAR-T治疗CD19+急性淋巴细胞白血病患者的缓解率可达到90%[2]，这肯定了CAR-T的临床价值，也使更多的研究者致力于CAR-T治疗实体瘤的研究。

Feng等[3]报道，用靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的CAR-T治疗11例复发难治的非小细胞肺癌患者，2例患者获得部分缓解，5例稳定，没有严重不良事件发生。酪氨酸蛋白激酶受体A2(EphA2)在90%以上的非小细胞肺癌组织中高表达，但在正常的肺组织中却没有明显的表达。Li等[4]的体外实验表明靶向EphA2的CAR-T可以使EphA2阳性的肺癌细胞溶解。Wei等[5]的研究表明靶向PSCA和MUC1双靶点的CAR-T在体外也可杀伤肺癌细胞。

CAR-T在神经系统恶性肿瘤中也取得了一定的疗效。Louis等[6]用靶向GD2的CAR-T治疗19例神经母细胞瘤，3例患者获得了完全缓解，没有严重不良反应。O′Rourke等[7]用靶向EGFRvⅢ的CAR-T治疗10例胶质母细胞瘤，1例患者持续稳定超过18个月，没有明显的不良反应。Ahmed等[8]用靶向HER2的CAR-T治疗17例胶质母细胞瘤，其中1例患者获得部分缓解且维持超过9个月，7例患者稳定且维持2～29个月，不良反应可耐受，没有剂量限制性不良反应。Brown等[9]报道了脑室内注射靶向IL13Ra2的CAR-T治疗1例胶质母细胞瘤的疗效，患者获得了完全缓解，且维持了7.5个月。

有学者[10]报道了1例恶性胸膜间皮瘤患者接受靶向间皮素的CAR-T治疗，该患者部分缓解且维持6个月。2017年，Feng等[11]报道了1例胆管癌患者接受靶向EGFR的CAR-T治疗后获得8.5个月的部分缓解，随后接受靶向CD133的CAR-T治疗，又获得了4.5个月的部分缓解。有学者[9]报道了1例胶质母细胞瘤患者接受靶向间皮素的CAR-T治疗，该患者持续稳定维持了77 d，显示了一定的疗效。2018年，Beatty等[12]报道了6例难治性转移性胰腺癌患者接受靶向间皮素的CAR-T治疗，结果显示2例病情稳定，无进展生存时间分别为3.8和5.4个月。2017年，Zhang等[13]报道用靶向CEA的CAR-T治疗10例转移性结直肠癌患者，其中7例稳定，没有发生严重的不良反应。Ahmed等[14]用靶向HER2的CAR-T治疗19例肉瘤患者，4例患者稳定维持3～14个月。目前多项CAR-T治疗实体瘤的临床试验正在进行中，CAR-T治疗实体瘤的临床效果见表1。

表1 CAR-T治疗实体瘤的疗效

PR：部分缓解；CR：部分缓解；SD：稳定

2 CAR-T治疗实体瘤的挑战

CAR-T治疗实体瘤取得了一定的疗效，但仍然面临很多挑战，主要包括靶点的选择、免疫抑制微环境的解除、联合治疗等。

2.1靶点的选择目前研究较多的靶点有间皮素、HER2、CEA、神经节苷酯(GD2)、EGFR等。间皮素是一种细胞表面糖蛋白，其过表达可以增强细胞的增殖、侵袭和转移能力[15-17]。间皮素在恶性胸膜间皮瘤、肺癌、食管癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中过表达[18]，在正常胸膜、腹膜、心包中低表达。HER2是一种跨膜蛋白，它通过PI3K/AKT和Ras/Raf/Mek/MAPK通路调节细胞的增殖、分化和存活[19]。HER2在乳腺癌[20]、肺癌[21]、胃癌[22]、胶质瘤[23]、胰腺癌[24]组织中高表达。Sun等[20]和Mata等[25]通过动物实验证实了靶向HER2的CAR-T在乳腺癌和骨肉瘤治疗中的有效性。但是，由于靶向HER2曾有致死病例，因此治疗时仍要综合评估其安全性。GD2是细胞表面的糖脂类分子，它在很多恶性肿瘤组织中过表达[26]。Louis等[6]报道了靶向GD2的CAR-T治疗神经母细胞瘤的疗效。EGFR又称ErbB-1或HER1，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路在细胞的生长、增殖和分化等过程中发挥重要的作用。EGFR过表达于多种肿瘤组织中，与预后不良和存活率降低有关[27]。临床前研究[28]表明脑内注射靶向EGFRvⅢ的CAR-T可以显著延长胶质瘤小鼠的生存期。另一项临床前研究[29]显示异种胶质母细胞瘤小鼠静脉注射靶向EGFRvⅢ的CAR-T也可以使肿瘤缩小。癌胚抗原(CEA)是一种细胞表面的糖蛋白，在多种上皮癌尤其是结直肠腺癌组织中过表达，可作为结直肠癌诊断和预后的指标。由于CEA在正常组织中也有表达[30]，所以靶向CEA的CAR-T的安全剂量有待进一步的研究。上皮细胞黏附分子(EpCAM)是跨膜糖蛋白，是Ca2+非依赖性上皮细胞间的黏附分子。EpCAM被认为是肿瘤干细胞的标志。研究[31]发现，靶向EpCAM的CAR-T可以延长前列腺癌模型小鼠的生存期。

靶点的选择是CAR-T治疗实体瘤的很大挑战，因为很少有特异性的抗原仅表达于肿瘤细胞而在正常组织中无表达，这就使CAR-T治疗实体瘤存在“脱靶效应”，严重的甚至有致死病例报道。Morgan等[32]报道了1例结肠癌患者接受靶向HER2的CAR-T治疗后死亡，其主要原因是HER2在肺血管等一些正常组织中低表达，CAR-T在杀伤肿瘤细胞的同时，对肺组织也产生伤害作用，引起呼吸衰竭而死亡。Lamers等[33]在针对肾细胞癌的碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ)的CAR-T研究中发现，因CAⅨ在正常胰胆管上皮、胃黏膜、小肠隐窝细胞上低表达，脱靶效应可引起自身免疫性胆管炎和严重的肝损伤。为了减少脱靶效应，增加安全性，现在主要从以下几方面对CAR-T技术进行改进：①导入自杀基因，如HSV-tk、Caspase9、EGFR、CD20，在前体分子的作用下CAR-T可发生凋亡[34-37]。②制备非永久表达CAR-T，这样可以减少对正常组织的损伤。Beatty等[10]将表达间皮素CAR的mRNA序列转染至胰腺癌患者T细胞中,这种CAR-T仅在人体内存在1～2个月，该患者腹腔转移明显好转而未见其他脏器的损害。这种方法理论上可能会影响CAR-T的疗效，还有待进一步研究。③设计识别双抗原的CAR-T，同时识别A抗原和B抗原才能激活CAR-T产生杀伤作用，使杀伤更精准，避免脱靶效应的发生[38-39]。

2.2免疫抑制微环境的解除实体瘤微环境中存在大量的纤维基质和免疫抑制细胞，通过物理屏障和免疫屏障保护肿瘤组织，抵抗免疫细胞的攻击[40]。克服免疫抑制微环境可以改善CAR-T的疗效。免疫抑制微环境的解除途径主要有以下几个方面：①免疫检查点。当T细胞与肿瘤细胞接触时，T细胞的免疫检查点与肿瘤细胞上的免疫检查点相结合，抑制T细胞发挥抗肿瘤功能。目前研究比较多的免疫检查点主要有程序性细胞死亡因子1[40]、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4[41]、淋巴细胞活化基因 3 蛋白、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白 3。针对免疫检查抑制，CAR-T治疗目前采用2种改进策略，一种为CAR-T与免疫检查点抑制剂如Nivolumab和Pembrolizumab等联合用药[42]，另一种为制备靶向免疫检查点的CAR-T[43]。这2种方式都可以增强CAR-T的功能[44]。②免疫抑制分子，如TGF-β、IL-10[45]。为了克服免疫抑制分子的作用，可以改造CAR-T不表达免疫抑制分子。③免疫抑制细胞，如Tregs、髓系抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)/肿瘤相关中性粒细胞。Tregs可以直接抑制CAR-T的功能，也可以通过表达免疫抑制分子抑制CAR-T的功能[46]。为了克服这种免疫抑制细胞，有研究者[47]将CAR设计为同时靶向肿瘤细胞和免疫抑制细胞的结构。Ruella等[47]报道了靶向CD123的CAR-T同时抗霍奇金淋巴瘤和TAM的可行性。

2.3联合治疗CAR-T单独治疗实体瘤疗效有限，现在很多学者在研究CAR-T联合其他治疗如化疗、放疗、免疫治疗的有效性。下面介绍联合治疗的现状。化疗联合CAR-T治疗：化疗可以改善CAR-T的疗效。一些研究[48-50]表明有些化疗药如环磷酰胺、阿霉素、奥沙利铂、氟达拉滨、吉西他滨等不仅可以减轻肿瘤负荷，还可以清除免疫抑制细胞。放疗联合CAR-T治疗：放疗不仅可以使放疗部位肿瘤缩小，还可以使远处肿瘤缩小，有研究[51]表明这是因为放疗可以增强免疫功能。另外，放疗可以使肿瘤细胞坏死，引起更多的肿瘤抗原表达，有利于CAR-T发挥抗肿瘤效应[52]。免疫检查点抑制剂联合CAR-T治疗:多项研究[43,53-56]证实该类联合治疗可以增强CAR-T的抗肿瘤效应。

3 总结和展望

CAR-T应用于实体瘤的研究还处于早期阶段，如何增强CAR-T的疗效是研究的热点。本文介绍了CAR-T治疗实体瘤的现状、克服免疫抑制微环境的手段以及联合治疗的优势。设想未来的CAR-T是这样的：能够更特异地靶向肿瘤细胞，CAR-T在体内维持时间更长，功能更强，能够克服免疫抑制微环境。世界各国研究者的共同努力将会推动CAR-T在实体瘤中的应用。