microRNA-20a靶向调控唾液酸转移酶ST8SIA2在结直肠癌耐药中的作用

宫晓红，王丹，沈宗坤，贾莉，刘铃



microRNA-20a靶向调控唾液酸转移酶ST8SIA2在结直肠癌耐药中的作用

宫晓红，王丹，沈宗坤，贾莉，刘铃

116013 辽宁，大连中医医院检验科（宫晓红）；114002 辽宁，鞍钢集团公司总医院检验科（王丹）；123000 辽宁，阜新中心医院检验科（沈宗坤）；116044 辽宁，大连医科大学检验医学院（贾莉）；118000 辽宁，丹东市第一医院检验科（刘铃）

探究基于 miR-20a 为探针调控 ST8SIA2 在结直肠癌耐药中的功能和机制，为寻求逆转药物提供新的治疗策略及靶点。

采用 RT-PCR、Western blot 分别检测结直肠癌 Lovo 细胞及其耐药细胞株 Lovo/5-FU 中 miR-20a、ST8SIA2 的表达水平；利用 CCK-8 及 Western blot 实验检测上调、下调 miR-20a 后两种细胞株的药物敏感性及其 ST8SIA2 的表达情况；靶基因预测及双荧光素酶报告实验验证 miR-20a 与 ST8SIA2的靶向关系；利用 CCK-8 实验进一步检测 Lovo 细胞中 miR-20a 和 ST8SIA2 表达调控对细胞药物敏感性的影响。

①与 Lovo 细胞相比，miR-20a 在耐药细胞株 Lovo/5-FU 中呈现高表达，ST8SIA2 呈现低表达；②特异性上调 Lovo 细胞中 miR-20a 表达，ST8SIA2 表达减弱，该细胞的药物敏感性减弱；③特异性下调 Lovo/5-FU 细胞中 miR-20a 表达，ST8SIA2 表达增加，该细胞的药物敏感性增强；④特异性上调 Lovo 细胞中 ST8SIA2 表达，可逆转 miR-20a 对细胞产生的作用。

miR-20a 及 ST8SIA2 的表达水平与结直肠癌耐药性密切相关，miR-20a 可能是通过靶向负调控ST8SIA2 的表达进而调控结直肠癌细胞的耐药。

结直肠肿瘤； miR-20a； ST8SIA2； 抗药性，肿瘤

结直肠癌是人类高发的恶性肿瘤之一，是全球第二位癌症相关死亡原因[1]。临床中一些结直肠癌患者在数次化疗后会出现肿瘤复发和进展，肿瘤细胞产生的耐药是导致化疗失败的主要原因，增加结直肠癌细胞的化疗敏感性尤为重要。

微小 RNAs（miRNAs）与恶性肿瘤的关系是近年来研究的热点。miRNAs 可通过翻译抑制或基因降解来调节基因表达[2]。研究表明，miR-20a 在结直肠癌的增殖、侵袭及上皮间质转化过程中起重要作用[3-4]。近年来研究表明，唾液酸糖基化修饰与肿瘤及其耐药有着密切的联系，但引起肿瘤的耐药机制尚未明确。本文旨在探讨 miR-20a 及唾液酸转移酶 ST8SIA2 与结直肠癌耐药的关系，从而为结直肠癌的治疗提供新的策略及靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 结直肠癌细胞株 Lovo 及人胚肾细胞株 293T（双荧光素酶报告实验用）购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；DMEM 高糖培养基及青霉素、链霉素购自美国 Gibco 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）购自美国 Sigma 公司；CCK-8 试剂购自美国 Selleck 公司；PVDF 膜购自美国 Pall 公司；兔抗鼠 ST8SIA2 多克隆抗体和兔抗鼠 GAPDH 多克隆抗体均购自英国 Abcam 公司；ECL 发光试剂盒及Quanti Tect Reverse Transcription Kit 购自美国 Thermal Fisher Scientific公司；Trizol 试剂、LipofectamineTM2000 及 ST8SIA2 pEGFP-N2 vector 均购自美国 Invitrogen 公司；miR-20a mimic/inhibitor 购自广州锐博公司；双荧光素酶报告质粒 pmirGLO 购自吉玛公司；DYY-12 型电泳仪购自北京六一仪器厂；RT-PCR 仪购自 Takara 公司；酶标仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；BM-66XB 型倒置荧光生物显微镜购自日本 Olympus 公司；二氧化碳培养箱购自美国 Thermo 公司；低温冰箱购自上海跃进医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用 10% 体积的热灭活胎牛血清，1% 体积的青霉素（100 μg/ml）、链霉素（100 μg/ml），90% 体积的 DMEM 培养基制成 Lovo 细胞培养液。取 10 ml 该培养液培养 Lovo 细胞于培养瓶中，并置于 37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养、传代。采用药物浓度递增诱导法建立 Lovo 的耐药细胞株，5-FU 药物梯度由 0.1 逐渐到 2 μg/L 培养半年左右，以此得到的细胞株命名为 Lovo/5-FU，为了维持其耐药性，该细胞株在含 2 μg/L的 5-FU 的培养液中培养，实验前需停药培养一周。

1.2.2 RNA 提取和 Real-time PCR 用 Trizol 法直接提取 Lovo、Lovo/5-FU 细胞的总 RNA。使用紫外分光光度计检测所提取的总 RNA 浓度和纯度。将提取的 RNA 按照反转录试剂盒说明书进行操作。反转录体系为 20 μl，分别在 25 ℃反应5 min，在 42 ℃反应 60 min，在70 ℃反应 5 min。将上述反转录得到的 cDNA 按照 SYBR Premix Ex Taq II加样体系，置于 Real-time PCR 仪进行实时定量 PCR 扩增。反应体系总体积为 25 μl，分别在 95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火。延长 30 s，总共 40 个扩增循环。整个实验过程重复进行 3 次。

1.2.3 免疫印迹分析 用 Lysis Buffer 裂解液裂解细胞，提取总蛋白，通过蛋白定量分析试剂盒定量蛋白质。蛋白上样前先煮沸 3 ~ 5 min 使其变性，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白。每孔上样量 40 μg 进行电泳，直到蛋白 marker 在 12% 的分离胶中完全分开。将目的蛋白所在位置的凝胶切下，通过转膜仪将凝胶上的目的蛋白转移到 PVDF 膜上。转膜完成后，将膜放入 5% 脱脂牛奶（TTBS 配制）中，置于 37 ℃封闭 2 h。再分别与兔抗鼠 ST8SIA2（1:1000），GAPDH（1:1000）多克隆抗体 4 ℃孵育过夜。第二天取出 37 ℃摇膜 2 h，PBS 洗膜 4 次，每次 8 min。加 HRP 标记的羊抗兔 IgG（1:5000），于 37 ℃孵育 1.5 h，再洗膜 4 次，每次 8 min。用 ECL 发光试剂盒显示条带，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参进行对照分析。

1.2.4 体外药敏分析 采用 CCK-8 法检测Lovo、Lovo/5-FU 及转染 miR-20a 后结直肠癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性。取生长对数期细胞悬液 100 μl（5 × 104个/ml）接种于 96 孔培养板中，待其贴壁完全后，于各孔中分别加入 10 μl 相应药物浓度的 5-FU。继续培养 72 h 后，加入 11 μl 的 CCK-8 试剂，孵育 4 h 后，于 450 nm 处检测其吸光度值。实验中每个 96 孔板中设置一组阴性对照孔（不加细胞，其他试剂正常加），每种细胞对 5-FU 药物设置一组阴性对照孔（不加药，其他试剂正常加），阴性对照及实验孔均做 5 个复孔。

1.2.5 双荧光素酶报告实验 设计与 miR-20a-5p 相结合的 ST8SIA2 的 3'UTR 序列以及突变序列，并分别将其构建到双荧光素酶报告基因载体 pmirGLO 上（由上海吉玛公司合成）。取对数生长期的 293T 细胞，胰酶消化，重悬细胞至 15 × 104/ml，取 500 μl 接种于 24 孔板，于 37 ℃，5% CO2培养箱中培养 24 h。弃培养基，加入 500 μl 无血清培养基。根据所加质粒和 RNA 的不同，共分 6 组（空质粒 control-ST8SIA2 + miR-20a mimic，空质粒 control-ST8SIA2 + miR-20a control，野生型质粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic，野生型质粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a control，突变型质粒 mu-ST8SIA2 + miR-20a mimic，突变型质粒 mu-ST8SIA2 + miR-20a control），每组 4 个副孔。先在 EP 管中配好每孔所需物质，即 100 μl无血清培养基，4 μl 质粒（0.1 μg/μl），1 μl RNA（20 pmol/μl），2 μl Lip2000，混匀，室温静置20 min，之后分别加入相应孔板中。48 h 后，根据双荧光素酶检测试剂盒说明书，裂解细胞，取细胞裂解液至 96 孔板，分别加入底物，进行萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性（作为内参）检测。比较野生型质粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic 组相对于野生型质粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a control 组的萤火虫荧光素酶活性变化量（经海肾荧光素酶活性标准化后）。

1.2.6 免疫荧光分析 Lovo、Lovo/5-FU 细胞转染 miR-20a mimic/inhibitor 后进行免疫荧光实验，检测转染后 ST8SIA2 的表达。将上述细胞分别接种至小平皿中，37 ℃ 5% CO2培养箱中过夜。第2 天贴壁后取出，PBS 清洗，用 10% 甲醛固定40 min。PBS 洗 3 次，加入 0.1% 的 Triton X-100 透化 5 min，用5% 的 BSA 室温封闭 1 h。接着细胞与兔抗鼠特异性 ST8SIA2（1:1000）抗体 4 ℃孵育过夜。次日，平皿取出复温 1 h，接着孵育二抗（1:400），在 37 ℃避光孵育 30 min。PBS 清洗 3 次，将样品覆盖 DAPI，室温避光放置 10 min，倒置显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-20a 和 ST8SIA2 在 Lovo 细胞及其耐药细胞株中的差异表达

采用 RT-PCR 检测 Lovo 及 Lovo/5-FU 细胞株中 miR-20a 和 ST8SIA2 的表达水平，采用 Western blot 检测在两细胞株中 ST8SIA2 的蛋白表达水平。如图 1 所示，与亲本 Lovo 细胞相比，miR-20a 在 Lovo/5-FU 细胞中高表达，ST8SIA2 的 mRNA 及蛋白均呈现低表达水平，表达差异具有统计学意义（< 0.05）。

图 1 miR-20a、ST8SIA2 在 Lovo 及 Lovo/5-FU 细胞中的差异表达（*P < 0.05）

Figure 1 Differential expression of miR-20a and ST8SIA2 in Lovo and Lovo/5-FU cells were shown (*< 0.05)

图 2 Lovo 及 Lovo/5-FU 细胞转染 miR-20a 的转染效率（A）和调控 miR-20a 的表达对结直肠癌细胞耐药性有显著影响（B）（*P < 0.05）

Figure 2 The transfection efficiency of miR-20a transfected with Lovo and Lovo/5-FU cells were shown (A) and regulation of miR-20a expression had a significant effect on drug resistance in colorectal cancer cells (B) (*< 0.05)

2.2 调控 miR-20a 的表达对结直肠癌细胞体外药敏性的影响

为了验证 miR-20a 是否参与结直肠癌耐药，通过转染技术，使 Lovo 中 miR-20a 表达升高，Lovo/5-FU 中 miR-20a 表达下降。RT-PCR 技术检测其转染效率，如图 2A 所示，转染前后 miR-20a 表达水平有显著性变化（< 0.05）。CCK-8 法分析了过表达 miR-20a 的 Lovo 细胞及干扰了 miR-20a 的 Lovo/5-FU 细胞对不同浓度 5-FU 处理后的细胞生存率，结果如图 2B 所示，过表达 miR-20a 后 Lovo 细胞对 5-FU 的敏感性下降；而干扰 miR-20a 的 Lovo/5-FU 细胞对 5-FU 的敏感性增加。

2.3 miR-20a 与 ST8SIA2 表达的相关性

采用 RT-PCR、Western blot 及免疫荧光对 ST8SIA2 的表达进行分析，图 3A 结果显示，Lovo 细胞过表达 miR-20a 后，ST8SIA2 的表达水平显著下降；图 3B 显示 Lovo/5-FU细胞下调 miR-20a 表达后，ST8SIA2 的表达水平显著上升（< 0.05）。

2.4 ST8SIA2 是 miR-20a 的靶基因

生物信息学分析表明，ST8SIA2 是 miR-20a 的潜在靶标（图 4）。为了验证这一结论，我们进行了双荧光素酶报告实验，结果显示（图 4），与 wt-ST8SIA2 + miR-20a control 组相比，wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic 组荧光素酶活性显著降低（< 0.05），mu-ST8SIA2 + miR-20a mimic 组荧光素酶活性没有变化，表明 miR-20a 可以靶向结合 ST8SIA2 的3'-UTR。

2.5 过表达 ST8SIA2 抑制 miR-20 对 Lovo 细胞药敏性的影响

为进一步明确 miR-20a 与 ST8SIA2 对结直肠癌细胞耐药的影响，我们对 Lovo 细胞进行了 miR-20a 和 ST8SIA2 的过表达。如图 5 所示，只有 miR-20a 过表达时与对照组比，细胞存活率增加，其耐药性显著增加（< 0.05）。同时过表达 miR-20a 和 ST8SIA2 时，细胞的存活率下降，其耐药性显著降低（< 0.05）。

3 讨论

近年来，随着基因组学、蛋白组学、糖生物学的发展，寻找抗肿瘤治疗的新策略正在向miRNA 等方面发展。关于 miRNA 与结直肠癌之间的关系，已有很多报道。有研究表明，MicroRNA-182 能够促进结直肠癌的增殖及转移[5]。结直肠癌中，MicroRNA-26b 靶向烟酰胺磷酸核糖转移酶，起到抑制肿瘤的作用[6]。miR-20a 可靶向 BNIP2 促进结直肠癌细胞耐药[7]。miR-149 可增强结直肠癌细胞对 5-FU 的敏感性[8]。结直肠癌细胞中存在异常表达的miRNA 受到更多人的关注。

图 3 Lovo 细胞过表达 miR-20a 后，ST8SIA2 的表达水平（A）和 Lovo/5-FU 细胞下调 miR-20a后，ST8SIA2 的表达水平（B）（*P < 0.05）

Figure 3 The levels of ST8SIA2 were revealed after Lovo cells overexpressed miR-20a (A) and the levels of ST8SIA2 were shown after Lovo/5-FU cells down-regulated miR-20a (B) (*< 0.05)

图 4 miR-20a 可直接靶向结合 ST8SIA2 的 3'-UTR（*P < 0.05）

Figure 4 miR-20a could directly target the 3'-UTR of ST8SIA2 (*< 0.05)

在不同的肿瘤中，唾液酸糖基转移酶的差异表达可作为癌症的预后指标以及治疗的潜在靶点[9]。有研究表明结直肠癌会发生糖基转移酶表达的改变，如 ST6Gal1 在结肠癌中表达上调，并与肿瘤细胞的侵袭和转移正相关[10]。关于 ST8SIA2 与结直肠癌的关系鲜有报道，但是有研究称 ST8SIA2 参与肝癌侵袭和耐药的发展[11]。因此。本文通过探讨 miR-20a 及唾液酸转移酶 ST8SIA2 参与结直肠癌耐药的可能机制，为诊断、治疗结直肠癌耐药提供新思路。

本研究中，我们采用 Real-time PCR 技术及Western blot 技术证实 ST8SIA2 在结直肠癌耐药细胞株中的表达显著高于结直肠癌敏感细胞株。进一步检测了 Lovo 细胞与 Lovo/5-FU 细胞中 miR-20a的表达量，发现与Lovo 细胞相比，在Lovo/5-FU 细胞中miR-20a 的表达量显著升高。为了验证miR-20a 与结直肠癌耐药的关系，我们上调了 Lovo 细胞中miR-20a 的表达，发现上调 miR-20a 后 Lovo 细胞体外对药物的耐药性显著升高。下调miR-20a 后，Lovo/5-FU 细胞对药物耐药性显著降低。以上结果表明 miR-20a 参与了结直肠癌的耐药，结直肠癌细胞对 5-FU 药物的耐药程度随着 miR-20a 表达的增加而增强。我们对转染后的细胞进行了 ST8SIA2 表达的检测，发现 miR-20a 与 ST8SIA2 的表达呈现负相关。因此，我们猜想 miR-20a 与 ST8SIA2 之间可能存在某种关联。

图 5 过表达 ST8SIA2 可逆转 miR-20a 对细胞药物敏感性的作用（*P < 0.05）

Figure 5 Over expression of ST8SIA2 could reversed the effect of miR-20a on cellular drug sensitivity (*< 0.05)

为进一步了解miR-20a 在结直肠癌耐药中如何发挥作用，我们意图找到 miR-20a 的潜在靶点。靶基因预测表明，ST8SIA2 是 miR-20a 的潜在靶标。我们利用双荧光素酶报告实验，验证了 ST8SIA2 确实是 miR-20a 的直接靶基因。之后我们对 Lovo 细胞进行了 miR-20a 和 ST8SIA2 的过表达，结果表明，过表达 ST8SIA2 后可逆转 miR-20a 对结直肠癌细胞的作用。本研究中，我们采用体外实验初步探讨了 miR-20a 参与结直肠癌耐药的机制，并没有进行体内实验及临床标本的进一步验证，我们将在后续工作中进行体内的验证及机制的深入研究。

综上所述，miR-20a 与结直肠癌细胞耐药的发生密切相关，并且可能是通过靶向负调控ST8SIA2 的表达进而促进结直肠癌的耐药。明确 miR-20a 在结直肠癌耐药中的作用机制，可为结直肠癌的治疗提供新的策略。

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Effect of microRNA-20a on the colorectal cancer drug resistance by targeting ST8SIA2

GONG Xiao-hong, WANG Dan, SHEN Zong-kun, JIA Li, LIU Ling

Department of Clinical Laboratory, Dalian Traditional Chinese Medical Hospital, Liaoning 116013, China (GONG Xiao-hong); Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Anshan Iron and Steel Group Corporation, Liaoning 114002, China (WANG Dan); Department of Clinical Laboratory, Fuxin Central Hospital, Liaoning 123000, China (SHEN Zong-kun); College of Laboratory Medicine, Dalian Medical University, Liaoning 116044, China (JIA Li); Department of Clinical Laboratory, Dandong First Hospital, Liaoning 118000, China (LIU Ling)

We aim to explore the mechanism of miR-20a to regulate ST8SIA2 in colorectal cancer drug resistance and to provide a novel therapeutic strategy and target of colorectal cancer.

The expression of miR-20a and ST8SIA2 was analyzed by real-time PCR and Western blot in colorectal cancer cells. CCK-8 and Western blot assays were used to detect the drug sensitivity and the ST8SIA2 expression in the two cell lines after up-regulation and downregulation of miR-20a, respectively. The interaction between miR-20a and its predicted target gene ST8SIA2 was confirmed by 3'-UTR dual-luciferase reporter assay. The cell viability was obtained to further investigate the drug sensitivity of Lovo cells upon transfection with miR-20a mimic and ST8SIA2.

miR-20a was highly expressed and ST8SIA2 lowly expressed in Lovo/5-FU cells. Overexpression of miR-20a in Lovo cells could decrease ST8SIA2 level, and decrease the chemosensitivity to anti-tumor drugs.Silencing of miR-20a in Lovo/5-FU cells resulted in the increased expression of ST8SIA2, and increased the chemosensitivity to anti-tumor drugs. Overexpression of ST8SIA2 could reversed the effect of miR-20a mimic on drug resistance.

The levels of miR-20a and ST8SIA2 were closely related to the drug resistance in colorectal cancer. miR-20a could regulate drug resistance in colorectal cancer cells by targeting ST8SIA2 expression.

Colorectal neoplasms; miR-20a; ST8SIA2; Drug resistance, neoplasms

LIU Ling, Email: 15614328@qq.com

刘铃，Email：15614328@qq.com

2018-09-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.006