大鼠尾腱细胞外基质制备方法及其用于肌腱损伤修复的前期研究

张凯红，刘雪剑，孙百川，黄绍代，鲁长风，曲鹏玮，韩运宁，余文，孙逊，许文静，汪爱媛，王玉，卢世璧，彭江，亓建洪



大鼠尾腱细胞外基质制备方法及其用于肌腱损伤修复的前期研究

张凯红，刘雪剑，孙百川，黄绍代，鲁长风，曲鹏玮，韩运宁，余文，孙逊，许文静，汪爱媛，王玉，卢世璧，彭江，亓建洪

271016 泰安，泰山医学院运动医学研究所（张凯红、曲鹏玮、韩运宁、亓建洪）；100853 北京，中国人民解放军总医院骨科研究所（张凯红、刘雪剑、孙百川、黄绍代、鲁长风、余文、孙逊、许文静、汪爱媛、王玉、卢世璧、彭江）

探究大鼠尾腱细胞外基质制备方法及其复合脂肪间充质干细胞构建微组织，为组织工程法修复肌腱损伤所需生物材料提供实验基础。

取 20 只 150 ~ 200 g SD 大鼠鼠尾作为实验材料，分别抽取出大鼠尾腱，经 PBS 彻底清洗后反复冻融 3 次，然后经过 1% SDS 于室温下处理 24 h，并用大量 PBS 清洗 1 周除去细胞残渣，最后60Co 消毒备用。对制备的大鼠尾腱细胞外基质进行病理学染色，观察细胞残留情况。同时，检测该来源的生物源性材料残留 α-Gal 含量。此外，观察制备的大鼠尾腱细胞外基质复合脂肪间充质干细胞对细胞增殖的影响。同时，用 CCK-8 试剂盒检测该生物材料的细胞毒性。

大体观察可见，经脱细胞处理过的尾腱体积增大，呈乳白色匀浆状。HE 以及 DAPI 染色结果显示，经脱细胞处理后的尾腱细胞核大量减少，细胞数量显著降低，每个高倍镜视野内细胞残余量不大于 5 个。脱细胞尾腱残留 α-Gal 含量与正常尾腱相比有统计学差异，脱细胞尾腱残留 DNA 极少。复合脂肪间充质干细胞培养 7 d 相比培养1 d 活细胞数量明显增多。CCK-8 毒性测试结果显示这种脱细胞大鼠尾腱的生物相容性较好，没有细胞毒性。

经过脱细胞方法制备的大鼠尾腱细胞外基质可有效除去细胞成分，并且与脂肪间充质干细胞有较好的生物相容性，可作为一种生物材料用于肌腱损伤修复。

细胞外基质； 肌腱修复； 大鼠尾腱

肌腱是维持关节稳定以及正常运动的重要结缔组织，由于肌腱组织细胞分布和营养血供较少，一旦损伤，其自我修复能力较差[1]。此外，肌腱的损伤还会导致一系列的并发症，诸如关节不稳、软骨损伤、骨性关节炎等，严重时甚至影响关节的正常功能。每年在全球范围内有超过 3000 万肌腱和韧带损伤病例发生[2]，其中大多数与体育相关。然而，用目前的治疗手段很难使损伤的肌腱完全恢复到伤前的状态。因此，如何提高损伤肌腱的愈合效果以及最大限度恢复其正常功能是目前医学面临的一项重大难题。

近些年来，组织工程技术逐渐运用到肌腱修复的领域，其中最关键的部分是选择合适的支架。理想的组织工程支架应该具备两点特性[3]：①与宿主产生良好的生物相容性，给种子细胞的生长分化提供一个合适的环境；②具备一定的生物力学特性。动物实验和临床研究显示，脱细胞肌腱能够降低组织的免疫源性，使其与宿主以及种子细胞产生良好的生物相容性，用其修复肌腱损伤能在一定程度上恢复肌腱正常功能[4]。此外，细胞外基质（ECM）能为种子细胞提供模拟正常机体的生长微环境，对维持干细胞特性有重要作用[5]。本研究采用脱细胞方法制备大鼠尾腱细胞外基质，探究复合大鼠脂肪间充质干细胞用于肌腱损伤修复的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

150 ~ 200 g SD 大鼠 20 只（雌雄不拒），由中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心提供。十二烷基硫酸钠（SDS）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；CCK-8 试剂盒购自日本 Dojindo 公司；α-Gal 试剂盒购自北京三药科技开发公司；DMEM 培养基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、胶原酶购自美国 Corning 公司；DAPI 购自美国 Vector 公司。Epoch Take3 微量孔板分光光度计为美国 Biotek 公司产品；微量注射器为浙江三爱仪器厂产品；冰冻切片机和SP8 激光共聚焦显微镜为德国 Leica 公司产品；DP70 荧光显微镜和 IX70 倒置相差显微镜均为日本 Olympus 产品；YT-CJ-2NB 超净工作台购自北京亚泰公司；低速台式离心机购自北京白洋公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脱细胞尾腱制备 取 20 只 SD 大鼠鼠尾，将鼠尾按关节节段分离，充分抽取尾腱于盛有 PBS 的培养皿中。PBS 清洗后，置于双氧水中浸泡过夜消毒。然后于–80 ℃深低温冰箱冷冻 10 min，37 ℃恒温水浴箱内处理 10 min，反复5 次。无菌 PBS 充分漂洗后，在无菌环境置于37 ℃摇床 1% SDS 振荡 24 h，PBS 漂洗 1 周，每次 3 h，即可获得脱细胞大鼠尾腱，最后60Co 消毒备用。

1.2.2 大鼠脱细胞尾腱大体以及组织学观察 大体观察脱细胞尾腱的形态、质地、颜色等，对脱细胞组织进行 HE、DAPI 染色，观察脱细胞的效果。

1.2.3 大鼠脱细胞尾腱残留 α-Gal 含量检测 将浓缩的洗涤液用蒸馏水或纯化水 20 倍稀释，分别在相应孔中加入抗体I反应后的样品或标准品上清液各 100 μl。用封板膜封板后，置于 37 ℃温箱中 60 min。小心揭掉封板膜，用移液枪吸干孔中液体，再每孔注入洗液 200 μl，浸泡 30 s，弃去孔板中洗液，洗涤 5 遍，尽量扣干。然后，在每孔中加酶标试剂 100 μl。封板膜封板，置于 37 ℃温箱中 30 min，再次冲洗孔板 5 遍。紧接着将 A 液和 B 液等体积混合均匀，每孔加入混合好的显色液 100 μl，轻轻振荡混匀，37 ℃温箱避光 30 min。最后取出酶标板，迅速在每孔加终止液 50 μl，轻轻振荡混匀，立即测定结果。在 450 nm 波长测定各孔的值。

1.2.4 脱细胞尾腱复合大鼠脂肪间充质干细胞共培养及观察 取适量无菌脱细胞尾腱于 6 孔板中，每个孔板加入 3 × 106个第二代大鼠脂肪间充质干细胞。然后注入含 10% FBS、1%双抗的低糖 DMEM 培养液，于 37 ℃、5% CO2条件下培养。1 d 和 7 d 后取出细胞-支架复合物进行死活细胞染色，在激光共聚焦显微镜下观测细胞存活情况。

1.2.5 细胞生物相容性检测 在 96 孔板中配制 100 μl 的细胞悬液，将培养板在 37 ℃、5% CO2条件下预培养 24 h。按照 CCK-8 试剂说明书制备适量浸提液，向培养板加入 10 μl 浸提液，然后将培养板在培养箱孵育 1、2、3、4、5、6 d。向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，将培养板在培养箱内孵育1 ~ 4 h，最后用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 脱细胞尾腱大体观以及组织学观察

脱细胞前大鼠尾腱呈瓷白色条束状，组织形态完整，表面光滑（图 1A）；脱细胞后大鼠尾腱稍透明，体积增大，束状形态不明显，局部形成胶冻状形态（图 1B）；风干冷冻后有一定孔隙率（图 1C）。HE 染色示大鼠尾腱脱细胞前组织排列紧密，结构完整，组织内肌腱细胞蓝染，细胞排列有序呈串珠样（图 1D）；大鼠尾腱脱细胞后，组织排列疏松，体积增大，几乎未见肌腱细胞残留（图 1E）。DAPI 染色示大鼠尾腱脱细胞前组织内可见大量细胞核蓝染（图 1F），排列紧密而有序；脱细胞后组织见少量细胞核残留（图 1G）。

2.2 脱细胞前后α-Gal 含量检测结果

对三组大鼠尾腱样本脱细胞前后 α-Gal 含量检测结果（图 2）进行统计学分析，差异有统计学意义（< 0.05），显示脱细胞前后大鼠尾腱 α-Gal 含量有差异。脱细胞后大鼠尾腱残留 α-Gal 含量明显降低。

2.3 脱细胞尾腱复合大鼠脂肪间充质干细胞共培养观察结果

脱细胞尾腱与大鼠脂肪间充质干细胞共培养死活细胞染色显示：1 d 时大量活细胞贴附，并且有较高的活性，少量死细胞出现（图 3A）。随着培养时间的延长，脂肪间充质干细胞持续扩增，到 7 d 时细胞活性也明显提高，未见死细胞数量明显改变（图 3B）。

2.4 细胞生物相容性检测

在培养周期内值总体呈上升趋势，实验组在各时间点测得的值高于对照组，但是差异没有统计学意义。因此，这种大鼠尾腱脱细胞后生物相容性好，没有细胞毒性，不会影响细胞正常的生长以及增殖（图 4）。

Figure 1 Preparation and observation of rat tail tendon (A: General morphology of rat tail tendon; B: Observation of decellularized rat tail tendon; C: The morphology of decellularized rat tail tendon after drying and freezing; D: HE staining of rat tail tendon; E: HE staining of decellularized rat tail tendon; F: DAPI staining of rat tail tendon; G: DAPI staining of decellularized rat tail tendon; Scale: 200 μm)

3 讨论

肌腱损伤经常发生在体育活动和其他高强度的体力劳动中，一旦损伤容易导致关节不稳以及异常的关节活动[6]。肌腱损伤的自我修复往往导致瘢痕组织形成，这使得肌腱组织力学性能降低，通常造成二次损伤。因此，肌腱损伤的功能性修复仍然是临床骨科面临的一个重大挑战。目前，有多种治疗肌腱损伤的方法，包括自体移植、同种异体移植、异种移植、缝合技术、肌腱假体修复等。然而，这些方法的远期治疗效果往往欠佳，不可避免地引起供体损伤、组织的排异反应和肌腱损伤复发等[7-10]。这些局限促使了肌腱组织工程的快速发展，目前，组织工程技术在肌腱损伤的修复中具有广阔的前景。

肌腱组织工程包括种子细胞、支架、生物活性因子等，其中支架材料是必不可少的一个关键因素。合适的支架不仅能够维持一定的生物力学性能，还可以给种子细胞提供一个良好的生长增殖环境[11]。基于这种理论，目前越来越多的生物源性材料（如细胞外基质）被应用于组织工程技术中[12]，其中肌腱细胞外基质是组织工程肌腱修复中一种常用的生物材料。在正常组织中，细胞外基质是一个复杂的网状大分子结构，占据着细胞间的空间，主要负责细胞间的信号传导、生长增殖的调控以及力学支撑[13]。据文献报道，肌腱细胞外基质富含大量的基质蛋白，它能促进种子细胞增殖以及向肌腱方向分化，同时维持干细胞表型，抑制异位骨化[14]。此外，肌腱细胞外基质源性支架明显增强修复组织的力学性能，同时通过抑制或者激活种子细胞的基质金属蛋白酶（MMPs）来调控肌腱损伤的修复过程[15]。

图 2 大鼠尾腱脱细胞前后 α-Gal 含量的比较

Figure 2 Comparison of the content of α-Gal in rat tail tendon before and after decellularization

图 3 脱细胞尾腱复合脂肪干细胞培养（A：共培养 1 d 大量活细胞贴附；B：共培养 7 d 活细胞数目增多，视野内见少量死细胞，标尺：100 μm)

Figure 3 Co-culture of decellularized rat tail tendon and ADSCs (A: A large number of living cells were attached at the 1 day of co-culture; B: The number of living cells was increased and a few dead cells were observed in the field of vision after 7 days co-culture. Scale: 100 μm)

目前，肌腱组织脱细胞方法主要有物理方法、化学试剂法和生物制剂法[16]。常用的物理方法包括机械搅拌、冻融法、加压、超声处理等，但由于单纯物理方法的脱细胞效果不佳，通常需要结合不同的脱细胞试剂配合使用。化学试剂有酸碱溶液、非离子型洗涤剂、离子型洗涤剂等。酸碱溶液最常见的有乙酸、过氧乙酸、透明质酸，这些试剂能够有效地破坏细胞膜以及细胞器，但同时还会影响 ECM 内的其他成分如糖胺聚糖（GAG）、细胞因子的活性，从而降低 ECM 的性能。非离子洗涤剂主要有曲拉通（Triton-100），它是应用和研究最广泛的洗涤剂之一，去细胞的作用极强，但同时往往会破坏 ECM 中的蛋白成分以及糖胺聚糖，适用于肥厚坚硬的组织，此外 Triton-100 对细胞还有较强的毒性[17]。生物制剂主要指的是酶类和非酶类试剂，酶类包括胰蛋白酶、核酶，非酶类试剂包括螯合剂，如 EDTA 和乙二醇二乙醚二胺四乙酸等。酶类试剂主要通过破坏核酸序列来瓦解细胞，能有效去除细胞内的核酸成分，但是需要适度的温度与 pH 值，因此酶类脱细胞效果一般，而且通常与其他试剂配合使用。而螯合剂是通过分离型金属离子对组织脱细胞起辅助作用，它能破坏蛋白-蛋白间的联系。但螯合剂对去除组织表面的细胞无效，因此常和酶类或洗涤剂联合使用[18]。

图 4 CCK-8 检测（在同一时间点，两组之间没有统计学差异，P > 0.05）

Figure 4 CCK-8 test (At the same time, there was no statistically significant difference between the two groups,> 0.05)

本文大鼠尾腱组织异常薄，通过剪碎后体积较小，因此采用反复冻融结合 SDS 脱细胞的方法制备肌腱细胞外基质。反复冻融可充分破坏细胞结构，且不会造成 ECM 蛋白成分的明显损失及影响 ECM 的超微结构。SDS 属于离子洗涤剂，是较强的脱细胞化学试剂。它能够有效去除组织中细胞成分，将组织中残留的细胞核成分以及蛋白彻底清除[19]。整个 SDS 处理的过程是在恒温摇床上进行的，能够提高脱细胞的效率。从实验结果来看，该种脱细胞的方法效果很好，得到的肌腱细胞外基质细胞残余量极少，免疫源性较低。这种脱细胞大鼠尾腱与脂肪间充质干细胞培养不影响细胞的生长增殖，具备良好的生物相容性，未发现明显的生物毒性，是组织工程肌腱技术中修复肌腱损伤的一种理想材料。由于本实验的局限性，这种大鼠尾腱脱细胞材料修复肌腱损伤的效果有待进一步的动物实验验证。

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Preparation method of extracellular matrix of rat tail tendon and its preliminary study on repair of tendon injury

ZHANG Kai-hong, LIU Xue-jian, SUN Bai-chuan, HUANG Shao-dai, LU Chang-feng, QU Peng-wei, HAN Yun-ning, YU Wen, SUN Xun, XU Wen-jing, WANG Ai-yuan, WANG Yu, LU Shi-bi, PENG Jiang, QI Jian-hong

Institute of Sports Medicine, Taishan Medical University, Shandong 271016, China (ZHANG Kai-hong, QU Peng-wei, HAN Yun-ning, QI Jian-hong); Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China (ZHANG Kai-hong, LIU Xue-jian, SUN Bai-chuan, HUANG Shao-dai, LU Chang-feng, YU Wen, SUN Xun, XU Wen-jing, WANG Ai-yuan, WANG Yu, LU Shi-bi, PENG Jiang)

To explore the preparation method of extracellular matrix of rat tail tendon, and to construct micro-tissue with adipose mesenchymal stem cells to provide the experimental basis for the repair of tendon injury.

20 SD rats (150 - 200 g) tails were used as experimental materials, the rat's tail tendons were extracted, washed thoroughly with PBS, frozen and thawed three times, then treated with 1% SDS at room temperature for 24 h. The cell debris was removed by washing with a large amount of PBS for 1 week, and finally60Co was disinfected for use. The pathological analysis of the material was carried out to observe the cell debris. Then, its α-Gal content was detected. In addition, the effects of complexed rat tail tendon extracellular matrix with adipose mesenchymal stem cells on cell proliferation were observed. At last, the cytotoxicity of the biomaterials was detected by CCK-8 kit.

The gross observation showed that the volume of the treated tail tendon was increased, and its shape was milky white homogenate. The results of HE and DAPI staining showed that the nucleus of the treated tail tendon was significantly reduced, the number of cells was decreased markedly, and the cells residue in each high magnification lens was not more than 5. The residual α-Gal content of the treated tail tendon was statistically different from that of the normal tail tendon. The number of living cells significantly increased after 7 days of co-culture. And the results of CCK-8 toxicity test showed that the biocompatibility of this treated tail tendon was good and no cytotoxicity was found.

The extracellular matrix of rat tail tendon prepared by this method can effectively remove the cell components, and have good biocompatibility with adipose mesenchymal stem cells, and can be used as a biomaterial to repair tendon injury.

Extracellular matrix; Tendon repair; Rat tail tendon

QI Jian-hong, Email: jhqi7281@163.com; PENG Jiang, Email:pengjiang301@126.com

国家自然科学基金（81572148）；国家重点研发计划（2016YF C1102104）；北京市科技专项（Z161100005016059）；山东省卫生科技发展计划（2015WS0109）；山东省自然科学基金（ZR2017LH018）

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com；彭江，Email：pengjiang301@126.com

2018-03-14

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.004