SIRT2沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响

牛虹，杨峰，唐静雯，田同德，李华华，岳光星，范伊晓，周浩本



SIRT2沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响

牛虹，杨峰，唐静雯，田同德，李华华，岳光星，范伊晓，周浩本

450008 郑州大学附属肿瘤医院中西医结合肿瘤内科

探究沉默信息调节蛋白 2（SIRT2）对人胃癌 SGC-7901 细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。

采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 SIRT2 在胃癌 SGC-7901 细胞和正常胃上皮 GES-1 细胞中的表达。采用 RNA 干扰技术处理 SGC-7901 细胞，SIRT2 沉默组转染靶向 SIRT2 的干扰小 RNA（SIRT2-siRNA1 组、SIRT2-siRNA2 组），阴性对照组转染 SIRT2-siRNA 阴性对照序列，空白对照组不转染。CKK-8 法和平板细胞克隆形成实验检测 SGC-7901 细胞增殖，Transwell 法检测 SGC-7901 细胞侵袭迁移能力，蛋白印迹检测 SGC-7901 细胞中 SIRT2、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）和磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）蛋白表达。

人胃癌细胞 SNU-1、KATO III、SGC-7901 中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均高于正常胃上皮 GES-1 细胞（< 0.05）。转染SIRT2-siRNA 的 SGC-7901 细胞中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均低于阴性及空白对照组（< 0.05）；转染SIRT2-siRNA 后，SGC-7901 细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均降低（< 0.05）；转染SIRT2-siRNA 后SGC-7901 细胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度显著下降（< 0.05）。

SIRT2 在胃癌细胞中表达上调，沉默 SIRT2 可能通过调节 PI3K/Akt 通路抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，推测 SIRT2 可能作为潜在靶标应用于胃癌的基因治疗。

沉默信息调节蛋白 2； 胃癌； 增殖； 侵袭； 迁移

胃癌（gastric cancer，GC）是一类发生于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，流行病学研究显示，GC 的发病率在世界范围内居第五位，死亡率居第三位[1]。虽然近年关于 GC 的检测和治疗技术取得很大改进，但 GC 患者的 5 年存活率仍很低，低于 30%[2]。由于 GC 患者早期无特异性症状，确诊时多数已进展至晚期，甚至转移至远端器官，研究显示，转移是导致GC 患者死亡的重要原因[3]，然而影响胃癌转移的机制尚不完全明确。因此，探究胃癌的转移、进展机制，有利于筛选更有效的治疗分子靶点，对于延长 GC 患者存活时间，改善预后具有重要意义。沉默信息调节蛋白 2（sirtuin-2，SIRT2）是组蛋白去乙酰化酶家族的一员，参与调解氧化应激、细胞程序性死亡等生物过程[4-5]。Hoffmann 等[6]研究发现，抑制 SIRT2 表达可明显促进非小细胞肺癌细胞的凋亡，降低迁移和侵袭能 力，然而目前尚缺少 SIRT2 对胃癌细胞的影响相关研究。本文在上述研究基础上，通过转染靶向作用于 SIRT2 的干扰小 RNA（siRNA），观察沉默 SIRT2 对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其机制，以期为胃癌的临床诊疗提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞系 SNU-1、KATO III、SGC-7901 细胞和人正常胃上皮 GES-1 细胞购自中国科学院细胞库；胎牛血清和 RPMI-1640 培养基购自美国ThermoFisher 公司；LipofectamineTM3000 转染试剂盒购自美国 Invitrogen 公司；AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix、Trizol 试剂、蛋白提取试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Transwell 小室购自美国 BD 公司；SIRT2-siRNA1、SIRT2-siRNA2、SIRT2-siRNA阴性对照（negative control，NC）序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔源磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗体、兔源 p-PI3K 抗体、兔源丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threoninekinase，Akt）抗体、兔源 p-Akt 抗体和缀合辣根过氧化物酶（HRP）羊抗兔二抗购自美国 Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SNU-1、KATO III、SGC-7901 及 GES-1 细胞常温条件下复苏，采用加有 10% 胎牛血清的新鲜 RPMI-1640 进行培养，加入链霉素、青霉素，放入 CO2培养箱常规进行传代培养，每两天更换一次培养基。稳定2 ~ 3 代后，细胞处于对数生长期时，收集用于实验。每种细胞设置5 个重复。

1.2.2 细胞转染及分组 收集稳定传代的对数期 SGC-7901 细胞，加入胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，以 1 × 105个/孔密度接种于 6 孔培养板，培养至细胞融合达 80% 左右，更换为不含胎牛血清的新鲜RPMI-1640 培养基，遵循 LipofectamineTM3000 试剂盒操作说明进行转染。实验分四组：空白对照组：不对SGC-7901 细胞转染任何外源序列；阴性对照组：对SGC-7901 细胞转染终浓度为 100 nmol/LSIRT2-siRNA NC 序列；SIRT2-siRNA 1 组：对SGC-7901 细胞转染终浓度为 100 nmol/L SIRT2-siRNA1 序列；SIRT2-siRNA 2 组：对SGC-7901 细胞转染终浓度为 100 nmol/L SIRT2-siRNA2 序列，每组设置 5 个重复。转染后置于培养箱中常规培养 6 h，更换为加有 10% 胎牛血清的新鲜RPMI-1640 培养基继续培养 48 h。收集各组 SGC-7901 细胞，实时荧光定量（real time quantitative，qRT）-PCR和蛋白印迹（Western blot）检测转染效率。

1.2.3 CKK-8 法检测SGC-7901 细胞增殖 将各组 SGC-7901 细胞分别以 5000 个/孔密度接种至 96 孔板，培养 0、12、24、36、48、60、72 h 后，遵循 CKK-8 检测试剂盒操作说明进行实验，检测各孔细胞在 450 nm 波长下的光密度（），绘制生长曲线。

1.2.4 平板细胞克隆实验检测SGC-7901 细胞增殖 将各组 SGC-7901 细胞制备单细胞悬液，以1000 个/皿密度接种至加有 6 ml RPMI-1640 的培养皿中，移液枪轻轻吹打混匀，置于 CO2培养箱中培养，每 12 小时观察一次细胞生长情况。当肉眼观察到明显细胞克隆形成时，将培养皿取出，统计培养皿中形成克隆的细胞数量，计算 SGC-7901 细胞克隆形成率，每组设置 5 个重复。克隆形成率=（形成克隆的细胞数量/ 1000）× 100%。

1.2.5 Transwell 法检测SGC-7901 细胞迁移和侵袭 将 Transwell 小室放入 24 孔板，收集各组 SGC-7901 细胞制备单细胞悬液，以 10 000 个/孔密度接种于小室上层，小室下层加入 600 μl含胎牛血清RPMI-1640 培养基，于 CO2培养箱孵育 24 h，取出小室，清洗风干后，95% 乙醇固定，加入 0.5% 结晶紫染色 15 min，洗去多余染液，小心去除小室滤膜上层未迁移细胞，置于显微镜拍照并统计迁移至滤膜下层的细胞数量。细胞侵袭实验首先将小室 50 μl 2.0 mg/ml 基底胶加入小室上层，胶凝晾干后接种SGC-7901 细胞，后续步骤同迁移实验。每组设置 5 个重复。

1.2.6 Western blot 检测 PI3K、Akt 蛋白表达情况 将各组 SGC-7901 细胞收集，采用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，测定蛋白浓度。分别取适量蛋白加入十二烷基苯磺酸钠（SDS）煮沸后，上样，采用 8% ~ 10% SDS-聚丙烯（PAGE）胶分离不同分子量的蛋白质。采用半干转膜仪将蛋白质由 PAGE 胶转至硝酸纤维膜，加入 5% 脱脂牛奶常温封闭 25 min；分别加入 1:1000 稀释的一抗，4 ℃孵育过夜；洗去一抗后，分别加入 1:5000 稀释的羊抗兔二抗，常温孵育 45 min；洗去二抗后，加入化学发光液，采用 Tanon 软件拍摄图像，以目的蛋白条带灰度值/内参 GAPDH 条带灰度值表示目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 SIRT2 在人胃癌细胞系中高表达

人胃癌细胞 SNU-1、KATO III、SGC-7901 中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均显著高于正常胃上皮 GES-1 细胞（< 0.05），结果见图 1、表 1。

2.2 转染效果检测

阴性对照组 SGC-7901 细胞中SIRT2 mRNA 和蛋白水平与空白组比较，差异无统计学意义 （> 0.05）；SIRT2-siRNA1 组、SIRT2-siRNA2 组 SGC-7901 细胞中SIRT2 mRNA 和蛋白水平均显著低于阴性及空白对照组（< 0.05），见图 2、表 2。

2.3 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 细胞增殖

阴性对照组 SGC-7901 细胞增殖能力与空白组比较，差异无统计学意义（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 组、SIRT2-siRNA2 组 SGC-7901 细胞增殖能力显著低于阴性及空白对照组（< 0.05），结果见图 3。

图 1 SIRT2 在人胃癌细胞系中表达情况

Figure 1 SIRT2 expression in human gastric cancer cell lines

细胞系Cell lineSIRT2/GAPDH mRNAProtein GES-11.05 ± 0.221.08 ± 0.24 SNU-13.19 ± 0.61*2.08 ± 0.32* KATO III3.25 ± 0.71*2.11 ± 0.36* SGC-79014.59 ± 0.89*2.47 ± 0.48*

注：n = 5，与 GES-1 细胞比较，*< 0.05。

Note: n = 5, compared with GES-1 cells,*< 0.05.

图 2 转染 SIRT2-siRNA 对 SGC-7901 细胞 SIRT2 表达的影响

Figure 2 Effect of SIRT2-siRNA transfection on SIRT2 expression in SGC-7901 cells

表 2 转染 SIRT2-siRNA 对 SGC-7901 细胞SIRT2 表达的影响（）

注：n = 5，与空白组比较，*< 0.05；与阴性组比较，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

2.4 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 细胞平板克隆形成

阴性对照组 SGC-7901 细胞平板克隆形成率与空白组比较，差异无统计学意义（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 组、SIRT2-siRNA2 组 SGC-7901细胞平板克隆形成率显著低于阴性及空白对照组（< 0.05），结果见表 3。

图 3 沉默 SIRT2 对SGC-7901 细胞增殖的影响（n = 5，与空白组比较，*P < 0.05；与阴性组比较，#P < 0.05）

Figure 3 Effect of silencing SIRT2 on the proliferation of SGC-7901 cells (n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05)

表 3 沉默 SIRT2 对 SGC-7901 细胞平板克隆形成率的影响（）

注：n = 5，与空白组比较，*< 0.05；与阴性组比较，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

2.5 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 细胞迁移、侵袭能力

如图 4 和表 4 所示，阴性对照组发生迁移和侵袭的 SGC-7901 细胞数量与空白组比较，差异无统计学意义（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 组、SIRT2-siRNA2 组发生迁移和侵袭的 SGC-7901 细胞数量显著低于阴性和空白对照组（< 0.05）。

2.6 沉默 SIRT2 抑制 SGC-7901 细胞中 Akt、PI3K 磷酸化程度

阴性对照组、空白组、SIRT2-siRNA 组 SGC-7901 细胞中 Akt、PI3K 蛋白表达总量比较，差异无统计学意义（> 0.05）。阴性对照组 SGC-7901 细胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度与空白组比较，差异无统计学意义（> 0.05）；SIRT2-siRNA1 组、SIRT2-siRNA2 组 SGC-7901细胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度显著低于阴性和空白对照组（< 0.05），结果见图 5、表 5。

图 4 沉默 SIRT2 对 SGC-7901 细胞迁移（A）、侵袭（B）的影响（标尺 = 100 μm）

Figure 4 Effect of silencing SIRT2 on migration (A) and invasion (B) of SGC-7901 plate clones (scale = 100 μm)

表 4 沉默 SIRT2 对 SGC-7901 细胞迁移能力的影响（）

注：n = 5，与空白组比较，*< 0.05；与阴性组比较，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

3 讨论

我国的胃癌发生率很高，目前已居于常见恶性肿瘤的第一位。胃癌患者早期症状不具有特异性，因此发现患病时多已进展至晚期，手术效果有限，目前主要使用手术结合化疗的治疗策略，但化疗的毒副作用大且肿瘤细胞易产生抗药性[7]。胃癌患者在疾病晚期多出现肿瘤病灶浸润和远处转移、侵袭，严重影响治疗效果，导致患者预后差，死亡率高[8]。因此，探究胃癌细胞转移和侵袭机制，寻找关键生物分子，可为其临床诊断和治疗提供新思路。

图 5 沉默 SIRT2 对 SGC-7901 细胞 Akt、PI3K 磷酸化程度的影响

Figure 5 Effects of silencing SIRT2 on the phosphorylation of Akt, PI3K in SGC-7901cells

SIRTs 是一类依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的去乙酰化酶，共包括 SIRT1 ~ SIRT7 七种同源蛋白，在肌肉、胃、肾脏等多种组织器官中表达[9]。SIRTs 通过调节组蛋白乙酰化/去乙酰化水平，调节 DNA 与组蛋白的结合状态，影响基因转录，在能量代谢、炎症反应、氧化还原平衡等生理过程中发挥重要作用[10]。Cheng 等[11]发现，SIRT1 在结直肠癌肿瘤组织中表达显著高于癌旁组织，与患者远处转移、总体生存率有关，细胞实验表明，沉默 SIRT1 表达可显著抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭。Grbesa 等[12]发现，SIRT2 蛋白在非小细胞肺癌细胞系 NSCLC 细胞和肺原发肿瘤组织中表达高于正常肺上皮细胞和正常组织，SIRT2 高表达与肺癌患者无复发生存期有关，下调 SIRT2 表达可显著抑制 NSCLC 细胞增殖，推测 SIRT2 在肺癌中具有致癌作用。本研究发现，SIRT2 在胃癌细胞系 SNU-1、KATO III、SGC-7901 中均显著高表达，与 Li 等[13]研究一致，提示SIRT2 可能参与胃癌发生。

表 5 沉默 SIRT2 对 SGC-7901 细胞 Akt、PI3K 磷酸化程度的影响（）

注：n = 5，与空白组比较，*< 0.05；与阴性组比较，#< 0.05。

Note: n = 5, compared with the blank group,*< 0.05; compared with the negative group,#< 0.05.

肿瘤的发生涉及多种因素共同作用，当恶性肿瘤发生时，细胞在基因水平上对自身的控制出现紊乱，细胞增殖出现异常，细胞侵袭能力显著增加，表现为浸润式生长，导致肿瘤发生[14]。细胞异常增殖是肿瘤发生的基础，细胞迁移和侵袭是肿瘤发生远端转移的基础。本研究以 SIRT2 表达水平最高的 SGC-7901 细胞作为沉默 SIRT2 表达的载体，结果发现，转染 SIRT2-siRNA 后，SGC-7901 细胞 SIRT2 表达明显上调，表明转染成功，效率较高。进一步观察发现，SIRT2-siRNA1、SIRT2-siRNA2 组 SGC-7901 细胞生长速度、平板克隆形成率、发生迁移和侵袭的细胞数量均显著低于阴性和空白对照组，表明沉默 SIRT2 可有效抑制胃癌 SGC-7901 细胞增殖、迁移和侵袭能力，与冉龙宽等[15]对肝癌细胞增殖能力的研究一致。

PI3K/Akt 通路是细胞内一种调控细胞增殖、细胞侵袭的重要信号转导通路之一。作为通路中关键因子，PI3K 被磷酸化激活后，可催化细胞中 PIP2 转化为有活性的 PIP3，作用于下游靶蛋白 Akt 促进其磷酸化；活化的 Akt 由细胞质转移至细胞膜，传递生物学信号，进一步促进其下游细胞增殖、细胞迁移等相关靶基因转录活化，调节细胞功能[16]。研究表明，PI3K/Akt 信号通路的异常激活可促进多种肿瘤细胞增殖和迁移，与多种恶性肿瘤的严重程度有关[17]。Yang 等[18]发现，转录因子 SOX2 可通过诱导 PI3K/Akt 通路激活，促进人喉癌细胞的迁移和侵袭。Yan 等[19]研究证实，miR-21 在人乳腺癌细胞中可通过直接靶向 PI3K，抑制 PI3K/Akt 通路活化，从而抑制乳腺癌细胞生长、迁移和转移。近年研究发现，SIRT2 与 Akt 活化相关，SIRT2 过表达可增强 Akt 及其下游靶基因活化[20]。为探究 SIRT2 对胃癌细胞增殖、侵袭的作用机制，本研究对转染 SIRT2-siRNA 后，SGC-7901细胞中 PI3K、Akt 表达情况进行检测，结果发现，SIRT2-siRNA1、SIRT2-siRNA2 组 SGC-7901 细胞中 Akt、PI3K 蛋白磷酸化程度均显著降低，表明沉默 SIRT2 表达可有效抑制PI3K/Akt 通路激活，提示SIRT2 可能通过 PI3K/Akt 通路调节胃癌细胞的增殖、迁移和转移。

综上所述，SIRT2 在胃癌细胞中表达上调，沉默 SIRT2 可抑制 PI3K/Akt 通路激活，抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，表明 SIRT2 可能通过 PI3K/Akt 通路调节胃癌细胞的增殖、迁移和转移，推测 SIRT2 可能是胃癌基因治疗的潜在作用靶标。

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Influences of SIRT2 silence on proliferation, migration and invasion of gastric cancer SGC-7901 cells

NIU Hong, YANG Feng, TANG Jing-wen, TIAN Tong-de, LI Hua-hua, YUE Guang-xing, FAN Yi-xiao, ZHOU Hao-ben

Oncology Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Cancer Center of Zhengzhou University, Henan 450008, China

To investigate the influences and mechanisms of silencing sirtuin-2(SIRT2) on proliferation, migration and invasion of human gastric cancer SGC-7901 cells.

The expressions of SIRT2 in gastric cancer SGC-7901 cells and normal gastric epithelial GES-1 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The SGC-7901 cells were treated with RNA interference technique, the SIRT2 silence group was transfected with interfering small RNAs targeting SIRT2 (group SIRT2-siRNA1, group SIRT2-siRNA2), the negative control group was transfected with SIRT2-siRNA negative control sequence, blank control group was not transfected. CKK-8 assays and panel cell colony formation experiments were used to detect the proliferation of SGC-7901 cells. Transwell assay was applied to detect the invasion and migration abilities of SGC-7901 cells. The expressions of SIRT2, serine/threonine rotein kinase (Akt) and phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) in SGC-7901 cells were detected by Western blot.

SIRT2 mRNA and protein levels in human gastric cancer cells SNU-1, KATO III and SGC-7901 were higher than those in normal gastric epithelial GES-1 cells (< 0.05). The levels of SIRT2 mRNA and protein in SGC-7901 cells transfected with SIRT2-siRNA were lower than those in negative and blank control groups (< 0.05); after SIRT2-siRNA transfection, the proliferation, clonality, migration and invasion of SGC-7901 cells were decreased (< 0.05); after transfection of SIRT2-siRNA, the phosphorylation of Akt and PI3K proteins in SGC-7901 cells were decreased significantly (< 0.05).

SIRT2 is up-regulated in gastric cancer cells and SIRT2 silence may inhibit proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells by regulating PI3K/Akt pathway, on which it is speculated that SIRT2 may be used as a potential target for gene therapy of gastric cancer.

Sirtuin-2; Gastric cancer; Proliferation; Invasion; Migration

ZHOU Hao-ben, Email: blueskya143@126.com

周浩本，Email：blueskya143@126.com

2018-08-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.008