血管生长素基因在食肉目中的分子进化研究

郎大田 ，刘 娜 ，刘松菊

（昭通学院 a.农学与生命科学学院; b.医务室, 云南 昭通 657000）

生物进化一直是生物学者研究的热点问题，以DNA、蛋白质等生物大分子揭示生物进化谜底是最有效的方法之一，也是当前进化生物学研究的主要内容[1-4]。位于食物链顶端的食肉目(Carnivora)是哺乳动物第四大类群，包含11科280物种，分为猫型超科（獴科、猫科、灵猫科和鬣狗科）和犬型超科(鼬科、犬科、熊科、海豹科、海狮科、海象科和浣熊科)，许多种类分布在中国或中国特有，如大熊猫是我国野生动物重点保护对象之一[5]。研究显示食肉目具有独特的生境和进化历史，如生存在恶劣环境北冰洋的北极熊，是研究生物与环境相适应的重要模式生物[6]。

血管生长素基因（Angiogenin, ANG）主要拥有宿主防御功能，同时还具有促进血管壁生长、繁殖、损伤组织再生等功能[7,8]。因ANG序列拥有核糖核酸酶基因(Ribonuclease A, RNASE A)超家族典型特征，如：单个开放阅读框，编码区由信号肽和成熟肽组成，6个结构半胱氨酸形成3对二硫键维持结构稳定，具有一定的活性位点和“CKXXNTF”功能区等，故ANG又被命名为核糖核酸酶5基因（RNase5）[9,10]。随着现代分子生物学迅速发展和DNA二代测序技术相继出现及成熟，对RNASE A超家族及各成员的研究越来越深入，许多有趣的发现在生物顶尖杂志相继报道[11-15]，研究显示RNASE A超家族在有袋动物和胎盘类分歧之前发生扩张并起源于ANG[10]。

关于ANG进化研究，Zhang等发现6 个非人灵长目物种因一个碱基缺失使ANG变为假基因, 揭示该基因功能在这些物种中可有可无[13]。与灵长类不同的是,ANG在偶蹄目的牛(Bos taurus)、啮齿目的大鼠(Rattus norvegicus)和小鼠(Mus musculus)中检测到基因扩张,牛为2 个基因拷贝，大鼠和小鼠经历了不对称的基因扩张[14,16]。关于ANG最新研究，我们发现ANG在啮齿目Ctenohystrica亚目的所有物种发生丢失，而在另外两个亚目(与小家鼠相关的进化枝和与松鼠相关的进化枝)物种均检测到ANG，深入对RNASE A超家族分析，发现RNase1和RNase6在Ctenohystrica中发生了扩张，而在与小家鼠相关的进化枝和与松鼠相关的进化枝中为单拷贝，推测Ctenohystrica亚目ANG的功能可能被RNase1或 RNase6承担[17,18]。

为了深入开展ANG分子进化研究，本文以食肉目的2个超科的7科14个物种作为研究对象，旨在探讨食肉目ANG的分子进化，增加生物学者对ANG的认识，为后续深入研究提供理论基础。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料

以过去研究的食肉目物种大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)、家犬(Canis lupus familiaris)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已公布基因组的12个物种为研究对象，覆盖了食肉目2个超科7科，具体物种信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 ANG的鉴定

基于同源序列分析方法(TBlastn和Bblastn)，采用大熊猫ANG氨基酸序列和核酸序列作为查询序列，取E值为10-10，对已公布基因组的另外12个食肉目物种进行分析，鉴定出每个物种ANG。

1.2.2 序列比对和系统发育树的构建

利用软件Clustalx1.8.3[19]对食肉目ANG序列进行比对并人工矫正。采用邻接法（Neighbor-Joining,NJ）构建系统发育树，选择奇蹄目（Perissodactyla）犀科（Rhinocerotidae）的白犀牛（Ceratotherium simum）和马科 (Equidae)的马(Equus caballus）作为外群。使用MEGA 7.0软件[20]构建系统发育树，选用Kimura双参数模型（Kimura2-parameter）为核苷酸替代模型，对于插入缺失采用成对删除(pairwise deletion option)进行2000次自展重样（bootstrap）分析。

1.2.3 等电点的预测

RNASEA各成员功能与其等电点有密切联系，等电点高的成员拥有宿主防御功能，而等电点低的成员失去核糖核酸酶活性，具有生殖相关功能[9]。本文利用MEGA 7.0软件[18]删除食肉目ANG序列的空格并翻译为氨基酸，然后将氨基酸序列复制到在线预测网址（http://web.expasy.org/compute_pi）进行等电点预测[21]，共预测了食肉目11条功能基因，并计算其平均值。

2 结果

2.1 食肉目ANG序列

每个物种中均分析鉴定到1条ANG序列，未发现基因扩张及丢失，共获得14条ANG序列（表1）。除熊科大熊猫和犬科家犬ANG序列为Goo等人研究获得[9]，其余的12条序列均为本次基于已公布的食肉目基因组分析获得。在这14条ANG序列中，5条序列因非三联体的插入缺失致使终止密码子提前被认定为假基因，分别是犬科的非洲野犬、家犬，海豹科的韦德尔氏海豹、夏威夷僧海豹，鼬科的雪貂（表1）。

表1.食肉目物种及ANG基因信息Table 1.The information of carnivora and ANG.

食肉目14条ANG序列长度为430-461bp，比对后的长度为474bp。功能基因ANG序列长度为438-441bp，比对后的长度为441bp，经翻译为146个氨基酸和1个终止密码子，包括完整信号肽（1-24aa）和成熟肽（25-146aa），比对后的氨基酸序列均具有具有RNASE A超家族典型的特征：（1）具有催化活性氨基酸（2个组氨酸H，1个赖氨酸K）（;2）具有保守的CKXXNTF活性功能区，包含有催化活性的赖氨酸K；（3）6个半胱氨酸形成3对二硫键（封二图1）。

在线预测食肉目ANG的9条功能基因序列和外群的2条序列的等电点，其值在9.19（海獭）-9.88（北极熊）之间，物种间等电点并没有显著差异，平均等电点为9.52，明显高于RNASE A其它成员，特别是非典型成员RNas9-13（封二图1）。

2.2 系统发育分析

基于食肉目14个物种的14条ANG序列构建系统发育树（NJ），采用奇蹄目的白犀牛和马作为外群，得到一个与之相关的拓扑结构。封三图2显示拓扑结构进化枝长短不一，揭示食肉目物种ANG的进化速率存在差异。另外，4个猫型超科物种聚在一起且支持率较高（BS=79%），犬型超科的2个犬科物种进化枝较长，与猫型超科物种聚在一起，这一结果与家犬和非洲野犬ANG为假基因，未受到功能约束，进化速率较快可能有关。其次，犬型超科中海豹科与海象科形成姐妹群，支持率较高为93%。值得注意的是，本文获得的5条假基因序列，仅犬科2个物种的进化枝较长，而另外3个假基因物种（韦德尔氏海豹、夏威夷僧海豹和雪貂）的进化枝与其它物种相比没有显著差异。

3 讨论

本文基于NCBI上已公布基因组的14个食肉目物种为研究对象，覆盖了食肉目的2个超科（猫型超科和犬型超科），分析鉴定每个物种的ANG序列，旨在探讨ANG在食肉目中的进化奥秘。

在食肉目猫型超科和犬型超科的14个物种中，9个物种均拥有1个功能基因，而犬型超科犬科的非洲野犬、家犬，海豹科的韦德尔氏海豹、夏威夷僧海豹，鼬科的雪貂5个物种的ANG为假基因，与Zhang等发现一些非人灵长目物种ANG为假基因结果一致[13]，揭示ANG功能在食肉目这些物种可能是非必须的。

RNASE A超家族研究显示各成员等电点与其功能密切相关。等电点高的RNASE A超家族成员能与细菌细胞膜的负电荷紧密接触，破坏细菌细胞膜，具有宿主防御功能[22,23]，而等电点低的成员具有其它功能，如RNASE A超家族成员（RNase9-13）等电点明显低于其它成员，失去了核糖核酸酶活性而拥有生殖相关功能[24,25]。本文对食肉目ANG功能基因进行预测，发现ANG平均等电点为9.52，明显高于过去研究的其它成员，同时与功能有直接相关的RNASE A超家族结构特征在ANG中非常保守，未发现氨基酸的改变，揭示食肉目ANG仍拥有原有的宿主防御功能，未发生功能改变。

基于食肉目ANG真假基因构建的系统发育树显示猫型超科4个物种聚为一簇、犬型超科的海豹科与海象科形成姐妹群，但拓扑结构其它节点的支持率较低，这一结果可能与该研究的代表物种较少，ANG序列仅440bp左右有关，后续深入的研究应包含更多的代表物种及标记基因，才能提供食肉目较为真实可靠的亲缘关系。另外，犬科的2个物种非常引人注目，进化枝明显与其它物种存在差异，我们推测这一结果可能与ANG在2个犬科物种进化为假基因时间较长，进化速率明显快于其它物种有关。当然，也不排除犬科物种的ANG碱基序列因基因组质量存在一定的偏差甚至错误，今后需要设计引物对这2个犬科物种进行PCR扩增，验证其DNA序列质量。

本文基于食肉目14个物种开展ANG分子进化分析，共获得14条ANG序列，其中5条为假基因，揭示该基因功能在这些物种是可有可无的。在线预测显示ANG等电点较高，RNASE A超家族结构特征在ANG中未发生改变，显示食肉目ANG拥有原有的宿主防御功能，未发生功能改变。系统发育分析为后续深入研究提供了参考和方向。总之，本文增加了ANG研究的多样性，为深入认识ANG和RNASE A超家族提供了基础。