花椒油主要活性物质对荔枝霜疫霉的抑菌活性

曾令达， 黄仲景， 廖建良， 尹 艳， 宋冠华， 郑 倩

(惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007)

荔枝霜疫霉病是荔枝生产和果实贮藏中最主要的一种病害，会给产量和果品贮藏带来极大的损失[1-2]，其病原为荔枝霜疫霉[3]。南方夏季荔枝果实发育期及采收期正值高温多雨季节，荔枝果实极易受荔枝霜疫霉的侵染，造成果实腐烂变质。荔枝霜疫霉病在果园管理中仍以安克锰锌、瑞毒霉锰锌等化学药剂防治为主[4-5]，在荔枝生产中使用化学药剂容易造成荔枝霜疫霉抗药性提高，频繁用药又易造成环境污染和农药残留，存在安全隐患。因此，研究和开发植物活性物质防治荔枝霜疫霉病对环境和果品安全，对促进荔枝产业发展具有重要意义。目前，已研究发现一些植物的提取物对荔枝霜疫霉具有较强的抑制活性[6]。宋冠华等发现，白鲜、虎杖、蛇床等植物的乙醇提取物对荔枝霜疫霉有较强的抑制效果[7]。吴光旭等发现，开口箭中的1β，2β，3β，4β，5β，7α-六羟基螺甾-25(27)-烯-6-酮和螺甾-25(27)-烯-1β，2β，3β，4β，5β，6β，7α-七醇具有抗荔枝霜疫霉菌活性[8]。胡珊等研究发现，丁香酚、香芹酚、柠檬醛、肉桂醛等均对荔枝霜疫霉有抑制作用[9]。曾令达等发现，苦参提取物对荔枝霜疫霉具有较强的抑制作用[10]，但目前关于花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)油中的柠檬烯、桉树脑、月桂烯等3种主要活性物质对荔枝霜疫霉的抑菌效果和差异的研究未见报道。因此，本试验在离体培养条件下，运用菌丝生长法测定3种物质的抑菌活性，进一步探索植物提取物具有抑菌活性的原因，同时研究不同抑菌活性物质的抑菌能力差异，以及活性物质复配对荔枝霜疫霉的抑制作用，以期为探寻新型的植物源抑菌活性物质用于荔枝霜疫霉病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

供试菌种为荔枝霜疫霉菌(PeronophythoralitchiChen.)，由惠州学院生命科学学院植物学实验室提供。供试柠檬烯(纯度≥97%)、桉树脑(纯度≥99%)、月桂烯(纯度≥90%)、苦参碱(纯度≥98%)等，均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。吐温-80(分析纯)，购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 抑菌活性测定

1.2.1 单一活性物质的抑菌活性测定 在培养皿中倒入经高温高压灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，简称PDA)培养基[200 g马铃薯，20 g葡萄糖，15～20 g琼脂，1 000 mL 自来水，pH值自然]，制成平板后接种荔枝霜疫霉菌。于28 ℃培养7 d后荔枝霜疫霉菌菌种培养完成，用无菌打孔器沿着菌种菌落边缘打取直径为4 mm的菌饼。将柠檬烯和桉树脑纯品预先稀释成浓度为0.20 mg/mL的母液(加入适量的吐温-80作为分散剂)，将月桂烯纯品制成浓度为 25.00 mg/mL 的母液，经细菌过滤器过滤膜过滤后摄取适量的母液与已灭菌尚未凝固的PDA培养基混合，得到一定浓度含活性物质的培养基。培养基凝固后，用已灭菌的镊子将菌饼移接到含药培养基中央，将培养皿倒置，在28 ℃条件下进行恒温培养，7 d后用十字交叉法测量并记录菌落直径，同时以只添加吐温-80的培养基作为空白对照，每个处理重复5次。

抑菌率计算公式：抑菌率=(对照菌落净生长量-处理菌落净生长量)/对照菌落净生长量×100%。按抑菌率大小查生物统计概率值换算表，将抑菌率换算成相应的概率值，质量浓度用其对数值表示，以各抑菌剂浓度的对数值(X)和抑菌率的概率值(Y)求毒力回归方程Y=a+bX，并计算抑菌中浓度(EC50)。

1.2.2 活性物质复配物的抑菌活性测定及其增效比的计算 将柠檬烯和苦参碱预先稀释成浓度为0.1 mg/mL的母液(加入适量吐温-80作为分散剂)，摄取适量苦参碱、柠檬烯母液按1 ∶1(体积比)配制一定浓度的含活性物质的培养基。接种培养、菌落测定及EC50的计算同“1.2.1”节。

参照农药组合物协同增效作用判断方法[11]计算增效比。活性物质复配物的理论EC50计算公式为复配物理论EC50=(a+b)/[(a/A的EC50)+(b/B的EC50)]，式中，A、B分别代表不同植物提取物，a、b分别为2种提取物在混剂中含量的占比。以增效比(synergic ratio，简称SR)判定不同混合组配的抑菌物质的抑菌作用是否具有增效作用，SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用。SR计算公式为SR=EC50理论值/EC50实测值。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2007、SPSS 19.0进行统计的分析。

2 结果与分析

2.1 柠檬烯对荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表1可知，柠檬烯对荔枝霜疫霉菌的抑制率随着柠檬烯浓度的增加而变大。当柠檬烯浓度为2.0 mg/L时，抑菌率为11.5%，当柠檬烯浓度为16.0 mg/L时，抑菌率为89.8%，当柠檬烯浓度达到32.0 mg/L时，抑菌率达到100.0%，说明此时柠檬烯对荔枝霜疫霉菌菌丝生长具有完全的抑制作用。根据抑菌率和柠檬烯的浓度计算出柠檬烯的毒力方程为Y=3.680 8X+2.385 1，r2=0.911，从毒力方程得出柠檬烯对荔枝霜疫霉菌的EC50为7.2 mg/L。

2.2 桉树脑对荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表2可知，当桉树脑浓度为2.5 mg/L时，抑菌率为20.5%，而当桉树脑浓度为20.0 mg/L时，抑菌率达到了 86.7%，当桉树脑浓度为40.0 mg/L时，抑菌率为100.0%。随着桉树脑浓度的增加，对荔枝霜疫霉菌的抑制作用随之增大，当桉树脑浓度为40.0 mg/L时，对荔枝霜疫霉菌的生长具有完全的抑制用。根据抑菌率和桉树脑的浓度计算出桉树脑的毒力方程为Y=3.530 8X+2.118 1，r2=0.993，从毒力方程得出桉树脑对荔枝霜疫霉菌的EC50为6.5 mg/L。

表1 不同浓度柠檬烯对荔枝霜疫霉菌的抑制效果

表2 不同浓度桉树脑对荔枝霜疫霉菌的抑制效果

2.3 月桂烯对荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表3可知，当月桂烯的浓度为25.0 mg/L时，对荔枝霜疫霉的抑菌率为17.3%，当月桂烯的浓度为50.0 mg/L时，抑菌率为25.5%，说明月桂烯对荔枝霜疫霉菌有抑菌活性，但月桂烯的浓度增加了1倍，抑菌率才增加8.2%，说明月桂烯的抑菌效果较低。在月桂烯的处理浓度较大时，抑菌率有所增加，当月桂烯的浓度为200.0 mg/L时，抑菌率为 74.3%，而当月桂烯的浓度为400.0 mg/L时，抑菌率仅为88.2%。从月桂烯的不同处理来看，月桂烯对荔枝霜疫霉菌的抑菌率随着处理浓度的增加而加大，说明月桂烯对荔枝霜疫霉菌具有抑菌活性，但在较高处理浓度时，抑菌率未达100%。根据抑菌率和月桂烯的浓度可以计算出月桂烯的毒力方程为Y=1.727 6X+1.566 1，r2=0.976，从毒力方程得出月桂烯对荔枝霜疫霉菌的EC50为97.2 mg/L。

表3 不同浓度月桂烯对荔枝霜疫霉菌的抑制效果

2.4 苦参碱+柠檬烯复配剂对荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表4可知，当复配物浓度为2.0 mg/L时，抑菌率为 8.7%，当复配剂的浓度提高时，抑菌率增加，当复配物浓度为32.0 mg/L时，抑菌率达到95.7%。将复配剂的浓度和抑菌率进行回归分析，得到复配剂的毒力回归方程为Y=2.597 6X+2.540 1，r2=0.953，EC50实测值为8.9 mg/L。通过计算复配剂的EC50理论值为16.4 mg/L，增效比为1.8，苦参碱与柠檬烯的复配作用表现为增效作用。

表4 苦参碱+柠檬烯复配剂对荔枝霜疫霉菌的抑制效果

注：苦参碱对荔枝霜疫霉菌的EC50为105.0 mg/L，数据暂未发表。

3 讨论与结论

花椒是一种重要的食用调味品、中药材、香料及木本油料树种，属芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)[12]。张怀予等分析发现，花椒油中成分共有73种化学物质，以萜烯、醇、酯类物质为主，柠檬烯、桉树脑、月桂烯的含量分别为 20.204%、5.049%、4.937%，这3种物质为花椒油的主要成分[13]。袁娟丽等发现，花椒挥发油主要化合物成份鉴定出的物质中有5种物质的相对含量超过60%，其中桉树脑占 15.64%、D-柠檬油精占13.72%、β-月桂烯占10.20%[14]。不同产地的花椒油成分不太一样，花椒果皮挥发油相对含量在3%以上，成分各有不同，但主要以单菇类物质为主，但共有的成分有柠檬烯、月桂烯、按树脑等[15]。花椒油对真菌有抑制作用，是天然的抑菌植物源物质[16]。唐裕芳等发现，花椒油含有的桉树油、其酯类、β-月桂烯、柠檬烯等成分有协同作用，具有一定的抑菌能力[17]。花椒油乙醇提取物对荔枝霜疫霉菌具有较好的抑制作用[10]。高红亮等发现，柠檬烯在橙汁保鲜中具有较好的保鲜效果[18]。柠檬烯是安全无毒、应用广泛的防腐剂，且具有广谱的抗菌性[19]。孟雪等发现，桉树脑对5种真菌具有一定的抑制作用[20]。郭阿君发现，月桂烯对枯草芽孢杆菌有抑制作用[21]。本试验中柠檬烯、桉树脑、月桂烯等3种物质对荔枝霜疫霉菌均表现出抑制作用，3种活性物质中桉树脑对荔枝霜疫霉菌的EC50最低，为 6.5 mg/L，其次为柠檬烯，为7.2 mg/L，月桂烯的最高，为 97.2 mg/L。

苦参碱属于四环喹嗪啶类化合物，是苦参、苦豆子、广豆根等豆科中草药的活性物质，分子式为C15H24N2O，相对分子质量为266[22-24]。苦参碱对多种真菌具有抑菌活性[25-26]。曾令达等用乙醇提取花椒和苦参的抑菌活性物质，发现苦参和花椒的粗提物按1 ∶1(体积比)复配对抑制荔枝霜疫霉菌具有增效作用[27]。本试验中以花椒中的活性物质柠檬烯与苦参碱按1 ∶1(体积比)进行复配，在对荔枝霜疫霉菌的抑制试验中增效比为1.8，两者复配具有增效作用。因此，从本试验的结果来看，可以从花椒中提取活性物质用于荔枝霜疫霉病的防治，为增加抑菌效果，可以选择与其他植物的活性物质进行复配。