锌肥对水稻根际土壤细菌碳代谢指纹的影响

杨 波， 靳辉勇， 屠乃美， 田茂成， 田 峰， 周 伟， 李栋宇

(1.湖南农业大学农学院，湖南长沙 410128； 2.湖南省烟草公司湘西自治州公司，湖南吉首 416000； 3.江苏省宿迁市宿豫区农业委员会，江苏宿迁 223800； 4.湖南省烟草公司永州市公司，湖南永州 425000)

锌是人体必需的微量元素，被称为“生命之花”[1]。锌也是植物必需的微量元素之一，对于提高作物产量和改善作物品质有着重要作用[2]。然而近年来由于土地复种指数的不断提高，氮肥的大量施用、酸性土壤过量施用石灰，导致土壤缺锌的现象越来越普遍和严重[3-4]。据统计，全球种植谷物的土地中有50%存在缺锌的潜在危险[5]。第2次全国土壤普查结果显示，锌是我国土壤第二大缺乏的养分元素，缺锌土壤比例占41.97%[6]。而刘铮统计发现，全国土壤缺锌范围已扩大到61%，其中西北、华北和东北等旱作区土壤缺锌更加严重，分别达到80%、70%和60%[7]。由此可见，施用锌肥是平衡土壤养分的重要措施。

碳代谢指纹又称代谢特征，不同种类微生物碳源偏好存在很大差异[8]。施用锌肥通过平衡土壤养分、改变土壤微生物群落结构及功能多样性，进而影响其代谢水平。李树真等研究了锌肥对油菜碳代谢的影响，结果表明，施用锌肥能够提高碳酸酐酶的活性，增强油菜碳素同化能力[9]。杨磊等通过对半夏叶片喷施锌肥发现，高浓度的锌肥有利于半夏叶片可溶性糖、可溶性蛋白以及淀粉等碳代谢指标的积累[10]。施木田等发现，锌、硼营养元素可提高苦瓜叶片光合强度、硝酸还原酶活性以及叶绿素、蔗糖、核酸等物质含量[11]。以上研究皆是探讨锌肥对作物碳代谢的影响，而锌肥对土壤微生物碳代谢的影响少有研究。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，而细菌是土壤微生物的主要类群，占土壤微生物总量的70%～90%[12-13]。在土壤养分转化、能量循环过程中，细菌发挥着重要作用，并且细菌具有根际效应，群落分布存在明显的差异，故分析水稻根际土壤细菌的碳代谢指纹更能敏感地反映出施用锌肥导致的土壤生态环境变化。鉴于此，本试验以水稻为模式作物，在大田条件下研究锌肥对水稻根际土壤细菌碳代谢指纹的影响，探讨其适宜的施用量，以期为粮食作物生产中锌肥的合理施用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种为湘早143。氮肥为尿素(含N 46%)，磷肥为过磷酸钙(含P2O512%)，钾肥为硫酸钾(含K2O 60%)，锌肥为(含7H2O·ZnSO434.5%)。

1.2 大田试验概况

试验于2016年在湖南省湘西土家族苗族自治州进行，试验田土壤为黏土壤，pH值为6.1，有机质含量为23.6 g/kg，碱解氮含量为112.4 mg/kg，速效磷含量为18.8 mg/kg，速效钾含量为123.2 mg/kg，有效锌含量为0.85 mg/kg。

1.3 试验设计

试验设6个处理，即对照CK(不施锌肥)、T1(施锌肥 10 kg/hm2)、T2(施锌肥20 kg/hm2)、T3(施锌肥30 kg/hm2)、T4(施锌肥40 kg/hm2)、T5(施锌肥50 kg/hm2)。每个处理重复3次，共18个小区。每个小区面积为20 m2，按4 m×5 m规格划定筑埂，并用塑料薄膜包裹隔离，实行单灌单排。小区整好后栽秧前锌肥拌细土作面肥施用。

1.4 样品测定方法

采用Garland和Mills的Biolog方法[14]，略有改动。在水稻收割后，称取10 g新鲜根际土样于250 mL灭过菌的三角瓶中，加入90 mL无菌NaCl溶液(0.85%)，封口后在摇床上振荡30 min(250 r/min)。然后静置15 min，吸取上清液5 mL于新三角瓶中，加45 mL无菌NaCl溶液，再将所得溶液稀释1 000倍，将稀释液接种到Biolog-ECO培养板上。随后将其置于25 ℃恒温箱中培养10 d，每隔1 d在Biolog微孔板读数仪上读取数值并记录。

1.5 数据分析

根据微生物对营养物质代谢途径的不同，将Biolog-ECO微孔板上31种底物碳源分为6类，具体见表1。试验数据用Excel 2003进行处理，采用SPSS 17.0软件进行方差分析及主成分分析。各指标计算公式为[15-17]

AWCD=∑(DC-DR)/n。

(1)

式中：DC、DR分别为反应孔、对照孔在590 nm下的吸光度，n为培养基碳源种类数。

丰富度指数=-∑(Pi×lnPi)。

(2)

式中：Pi为第i个孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比值。

(3)

式中：Di为第i孔的相对吸光度。

优势度指数=1-∑Pi2。

(4)

表1 Biolog-ECO微孔板上的碳源类型

2 结果与分析

2.1 碳源利用能力

2.1.1 各处理平均吸光值动态变化 平均吸光度(AWCD)是评价微生物对碳源底物平均利用能力的一个重要指标，用于反映土壤微生物群落代谢特征，AWCD越高，碳源利用能力越大[18]。由图1可知，在240 h的培养过程中，随着培养时间的延长，水稻根际土壤细菌对碳源的利用能力呈现先不断提高后趋于稳定的趋势。在刚开始培养的24 h内，各类碳源被利用得较少，说明此时微生物代谢并不活跃；在24～96 h内，AWCD快速增长，各类碳源被大量利用；96 h以后，AWCD趋于平稳，碳代谢也达到了稳定的状态。

羧酸类、聚合物类和其他类的AWCD整体上均表现为T5>T4>T3>T2>T1>CK，而在培养96 h后，糖类的AWCD也表现为这种现象，说明加大锌肥的施用量，有助于提高细菌对羧酸类、聚合物类、其他类和糖类这4种碳源的利用能力。整个培养期内，6类碳源CK处理的AWCD始终最小，表明施用锌肥可以促进细菌对碳源底物的利用。

2.1.2 不同处理水稻根际土壤细菌碳源利用主成分分析 为了进一步探究施用锌肥条件下主要碳源被利用的情况，选择培养96 h测定的AWCD，运用SPSS软件对数据进行主成分分析(表2)。共提取5个主成分，累计方差贡献率达92.4%，其中第1主成分(PC1)的方差贡献率为65.9%，第2主成分(PC2)的方差贡献率为11.5%，第3、第4、第5主成分方差贡献率均较小，未超过10%，分别为6.3%、5.3%、3.4%。因为PC1、PC2这2个主成分累计方差贡献率达到77.4%，已经可以解释大部分的原变量的特征，所以对PC1和PC2这2个主成分进行重点分析。

选取PC1和PC2这2个主成分进行分析，以PC1为x轴、以PC2为y轴作图，以不同处理在2个主成分上的得分值为坐标作图，得到了图2。从图2可以看出，各处理间的碳源利用得分差异非常明显，分别位于3个不同的象限。PC1轴上，T1、T2、T3、T4、T5这5个处理的得分均为负值，而CK处理为正值，表明PC1上的碳源是区分施用锌肥的敏感碳源。PC2轴上，得分值大小顺序为T3>T2>T5>T4>T1>CK，其中T3处理得分值最高，表明T3处理对PC2上的主要碳源影响较大；施用锌肥的处理得分值均大于对照，说明施用锌肥对PC2上的主要碳源影响大于不施锌肥。

碳源载荷值反映了相关碳源与主因子的相关性，载荷值越高，表示它对主成分的影响越大[19-21]。由表3可知，与PC1相关性较高(载荷值>0.6)的碳源有29个，其中羧酸类和糖类最多，均为8个，两者占总量的55.2%，氨基酸类、聚合物类、胺类和其他类分别有6、4、2、1个；与PC2相关性较高的碳源有2个，即2-羟基苯甲酸、D，L-a-磷酸甘油，这两者分别属于羧酸类和其他类。羧酸类、糖类、氨基酸类、聚合物类、胺类在PC1上相关性较高的碳源均多于与PC2相关性较高的碳源个数，其他类在PC1上相关性较高的碳源个数与PC2相等，均为1个。PC1上的碳源是区分施用锌肥的敏感碳源，结合图2可知羧酸类、糖类、氨基酸类、聚合物类、胺类这5类碳源是区分施用锌肥的敏感碳源。

2.2 多样性指数分析

不同的多样性指数可以从不同的方面来描述微生物群落的多样性[22]。其中，丰富度指数用来表征生态系统中物种的数目，优势度指数反映各个种群数量的变化情况，均一性指数用来描述物种中的个体所占比例[23-25]。本研究利用96 h的平均吸光度来分析施用锌肥条件下，水稻土壤细菌群落丰富度指数、优势度指数、均一性指数的差异。

由图3可知，不同处理之间均一性指数差异显著，丰富度指数和优势度指数无显著差异。均一性指数与锌肥施用量呈正相关，随着锌肥施用量的增加，均一性指数不断增加；T1、T2处理均一性指数与对照之间无显著性差异，T3、T4、T5处理均一性指数较对照分别提高了50%、88.4%、117.4%，且差异显著，说明增施锌肥有利于均一性指数的提高。

3 结论

微生物群落碳源利用能力可以反映微生物活性水平。低浓度的Zn2+不仅可以提高土壤微生物群落对碳源的利用，还可增加土壤微生物的总体活性[26]。本研究结果表明，施用锌肥后，改变了根际土壤细菌的代谢特征，主要表现为提高了对羧酸类、聚合物类、其他类和糖类碳源的利用率，这与龙新宪等的研究结论[27]相似。这可能是因为锌肥的施用平衡了该地区的土壤养分失调，改善了土壤结构，为细菌的生长发育提供了良好的生长环境，进而促进了细菌的新陈代谢，提高了细菌的活性，增加了对碳源的利用。

表2 不同水稻根际土壤细菌碳源利用主成分分析

研究表明，土壤中锌含量在适宜范围内，有利于增加土壤微生物群落的丰富度和功能多样性[28]。在本试验中，锌肥施用量在20～50 kg/hm2范围内，细菌均一性指数与锌肥施用量呈显著正相关。这将促进物种区系向健康的方向转变，对水稻根际土壤细菌生长繁殖有着重要的意义。

主成分分析结果表明，不同处理下，细菌对碳源的利用能力不同。施锌肥处理(T1、T2、T3、T4、T5)集中分布在PC1负半轴，而不施锌肥处理(CK)则位于PC1正半轴；羧酸类、糖类、氨基酸类、聚合物类、胺类这5类碳源在PC1上相关性较高，综合分析认为，长期施用锌肥会使细菌偏好羧酸类、糖类、氨基酸类、聚合物类、胺类物质为碳源。

表331种碳源的主成分载荷值

碳源名称载荷值PC1PC2丙酮酸甲脂0.946—吐温800.938—L-精氨酸0.937—L-丝氨酸0.920—L-苯基丙氨酸0.918—4-羟基苯甲酸0.914—D-木糖0.896—α-D-乳糖0.896—γ-羟基丁酸0.888—D-甘露醇0.883—甘氨酰-L-谷氨酸0.880—α-环式糊精0.872—苯乙基胺0.849—D-葡萄胺酸0.839—葡萄糖-1-磷酸盐0.836—L-苏氨酸0.833—肝糖0.821—D-半乳糖醛酸0.809—吐温400.798—N-乙酰基-D-葡萄胺0.793—衣康酸0.780—I-赤藻糖醇0.772—D-半乳糖内酯0.769—D-纤维二糖0.768—D-苹果酸0.761—β-甲基D-葡萄糖苷0.744—α-丁酮酸0.716—L-天冬酰胺酸0.685—腐胺0.652—2-羟基苯甲酸—0.625D,L-α-磷酸甘油—0.620