黄连素对脂多糖诱导小鼠血小板减少模型的保护作用

董亮 王淼 许华 王兵 王勇强

1天津医科大学一中心临床学院（天津 300070）；2天津中医药大学研究生院（天津 300193）；3天津市第一中心医院重症医学科天津市急救医学研究所（天津 300192）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰阴性菌细胞壁特有的组成成分，覆盖于细胞壁的最外层，是一种常见的病原相关分子模式识别配体［1］。LPS被细菌释放入血后可与机体相应细胞上的受体结合诱发炎症反应，在脓毒症发病过程中发挥至关重要的作用。血小板减少（thrombocytopenia，TCP）是脓毒症常见的并发症，研究表明血小板减少程度与脓毒症患者预后相关，脓毒症并发TCP是预后不良的重要标志［2］。因此，有效地缓解脓毒症并发TCP患者的血小板减少程度对此类患者的预后有很大的帮助。黄连素又称小檗碱（berberine，BBR），是一种从祖国传统中药黄连、黄柏等中药植物中提取出来的生物碱［3］。研究报道显示其具有较突出的抗炎作用，且能够在一定程度上抑制血小板聚集及LPS引起的炎症反应，然而其对脓毒症相关性血小板减少的作用尚未见报道［4-5］。本研究拟用单次腹腔注射LPS法制备小鼠TCP模型，并随机分组分别给予不同剂量的黄连素处理，观察黄连素对脂多糖诱导小鼠TCP模型是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级健康雄性C57BL/6小鼠100只，8周龄，体质量（20±2）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，证书：SCXK（京）2014-0004，于（25±2）℃，湿度45%～55%，每日光照8 h条件下饲养，期间自由饮水、进食，实验之前适应性喂养1周。

1.2主要试剂脂多糖（LPS）、黄连素（BBR）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA·2Na）（北京索莱宝科技有限公司），TNF-α ELISA试剂盒、IL1-β ELISA试剂盒、IL18 ELISA试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），小鼠CD41抗体、辣根过氧化物标记的二抗（BD Biosciences），苏木素染液（佰思诺（天津）生物科技有限公司）。

1.3实验分组、造模及给药将100只小鼠随机分为5组：空白对照组（C组）、LPS模型组（LPS组）、LPS+低剂量BBR组（L组）、LPS+中剂量BBR组（M组）、LPS+高剂量BBR组（H组），每组20只。其中治疗组给予不同剂量黄连素灌胃（低剂量BBR组给予5 mg/kg BBR，中剂量BBR组给予25 mg/kg BBR，高剂量给予50 mg/kg BBR），每天1次，连续3 d；第3天灌胃后3 h，LPS组及BBR干预组根据体重单次腹腔注射终浓度为25 mg/kg的LPS，以制备小鼠血小板减少模型，空白组根据体重给予腹腔注射适当的生理盐水。

1.4小鼠一般状况及生存率的观察在LPS注射后观察各组小鼠的饮食、排便等一般状况及72 h内的死亡情况。

1.5小鼠外周血血小板参数及炎症因子的测定分别于LPS注射后0、2、6、24 h，于小鼠目内眦采血30 μL，EDTA抗凝后全血细胞分析仪测血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板宽度（PDW）和平均血小板体积（MPV）；分别于LPS注射后0、2、6、24 h，于小鼠目内眦采血300 μL，取上清，用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β和IL-18的表达情况。

1.6免疫组化检测各组小鼠肺组织血小板滞留情况于LPS注射24 h取血后，颈椎脱臼处死小鼠，取肺脏组织，10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋并切片，脱蜡、抗原修复后加3%过氧化氢溶液室温避光孵育25 min，PBS脱色洗涤3次，BSA封闭30 min，小鼠CD41抗体，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，二抗室温孵育50 min，PBS洗涤3次并用DAB显色，苏木素复染、冲洗，脱水封片，观察并分析结果。

1.7统计学方法分别应用SAS软件、SPSS Statistics 17.0软件进行统计学分析。对不同时间点的多次测量资料采用重复测量方差分析，组间比较采用SNK-q检验；采用Kaplan-Meier法比较组间生存率，多组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性检验采用LSD检验方法，方差不齐时采用Dunnett′s T3检验方法。计量资料以表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1BBR对LPS诱导TCP小鼠一般状况的影响在LPS注射24 h时观察各组小鼠的一般状况，发现对照组小鼠活动量正常，对外界刺激反应迅速，毛发光泽，饮食、排便情况正常，眼部无充血、粘连、溃烂等情况。LPS处理组小鼠表现出无活动，对外界刺激反应力迟钝或无反应，身体卷躯，聚集成堆，寒战，嗜睡，毛发暗淡、竖立，眼结膜充血、分泌物增多甚至粘连、溃烂，饮食量下降，大便稀溏。BBR干预组小鼠表现为活动量减少，对外界刺激反应力减弱或迟钝，毛发虽暗淡，但眼结膜无充血及分泌物，饮食量亦下降，但大便成形偏软或干燥，整体表现较LPS组有所改善。

2.2BBR对LPS诱导TCP小鼠生存率的影响通过观察各组小鼠72 h内的生存率，结果显示C组、M组、H组72 h生存率为100%；LPS组72 h内生存率为60%，48 h内生存率为70%，24 h内生存率为90%；L组72 h内生存率为80%，48 h内生存率为80%，24 h内生存率为100%。提示，M组、H组生存率高于LPS组，差异存在统计学意义（χ2=4.71，P=0.03）（图1）。

图1 BBR对LPS诱导TCP小鼠生存率的影响Fig.1 Effect of BBR on the survival rate of LPS-induced TCP mice

2.3BBR对LPS诱导TCP小鼠外周血血小板参数的影响分别收集LPS注射后0、2、6和24 h的外周血并检测血小板参数，结果显示，除C组外，其余各组从0～24 h，外周血中PLT和PCT均逐渐下降，且与C组相比，LPS组、L组、M组、H组在2、6、24 h的PLT和PCT均明显降低，差异存在统计学意义（P＜0.05或P＜0.001）。其中PLT结果分析显示，与LPS组相比，M组、H组在2、6、24 h的PLT高于LPS组（P＜0.001）。L组在2 h的PLT高于LPS组（P=0.002），L组在6、24 h的PLT与LPS组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。L组在2、6、24 h的PLT低于M组、H组，差异具有统计学意义（P＜0.001）。H组在6 h的PLT高于M组，差异具有统计学意义（P=0.004），但在2、24 h的PLT两组差异无统计学意义（P＞0.05）（图2A）。PCT结果分析显示，LPS组仅在24 h的PCT显著低于M组和H组，差异具有统计学意义（P=0.047，P=0.02）；其余时间点，L组、M组、H组的PCT与LPS组无统计学差异（P＞0.05）（图2B）。PDW和MPV检测结果显示，从2、6到24 h，除C组外，其余各组的PDW和MPV均逐渐升高，且与C组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.001）。但BBR干预组与LPS组组间及BBR干预组组间PDW值相比无统计学意义（P＞0.05）（图2C）。与C组相比，LPS组、L组在2、6、24 h的MPV均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001）；而M组与H组在6 h和24 h时的MPV值与C组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），但BBR干预组与LPS组组间及BBR干预组组间MPV值相比差异无统计学意义（P＞0.05）（图2D）。

2.4BBR对LPS诱导TCP小鼠外周血炎症因子表达的影响通过对LPS注射后各时间点小鼠外周血血清中TNF-α、IL-1β和IL-18表达情况的检测，结果显示：在LPS注射后，除C组外，其余各组的TNF-α、IL-1β和IL-18表达量均随观察时间的延长而降低，且与C组相比，其余各组的TNF-α、IL-1β和IL-18水平在LPS注射后2、6、24 h均显著增高（P＜0.001，其中H组在24 h的IL-18水平较C组高但差异无统计学意义）；与LPS组相比，M组、H组在2、6、24 h时各因子水平明显低于LPS组（P＜0.05或P＜0.01），L组在2 h时各因子水平明显低于LPS组（P＜0.05或P＜0.01），在6 h时，TNF-α和IL-1β的表达水平低于LPS组（P＜0.05），在24 h时，各因子水平与LPS组相比均无显著差异（P＞0.05）（图3）；在LPS注射后2、6、24 h，L组的各因子水平均显著高于M组与H组（P＜0.05或P＜0.01），而M组的TNF-α的表达水平在6 h和24 h时高于H组（P＜0.001）（图3A），其IL-1β的表达水平在2 h和6 h时显著高于H组（P＜0.05）（图3B），而IL-18的表达水平在2 h、6 h、24 h均显著高于H组（P＜0.05或P＜0.01）（图3C）。

图2 全血细胞分析仪检测BBR对LPS诱导TCP小鼠外周血血小板参数的影响Fig.2 The effect of BBR on the peripheral blood platelet parameters of TCP mice induced by LPS by whole blood cell analyzer

图3 ELISA试剂盒检测BBR对LPS诱导TCP小鼠外周血炎症因子表达的影响Fig.3 ELISA kit for detecting the effect of BBR on the expression of inflammatory cytokines in peripheral blood of TCP mice induced by LPS

2.5BBR对LPS诱导TCP小鼠肺脏血小板滞留的影响通过收集小鼠肺脏组织并对其进行免疫组化实验检测，结果显示：模型组小鼠肺脏组织中CD41的IOD值均显著高于空白对照组（P＜0.01），BBR干预组小鼠肺脏组织中CD41的IOD值均显著低于LPS组（P＜0.01），L组IOD值高于M组、H组（P＜0.01）；M组、H组之间差异无统计学意义（P＞ 0.05）（图4）。

图4 免疫组织化学法检测BBR对LPS诱导TCP小鼠肺脏血小板滞留的影响Fig.4 Immunohistochemical method for detecting the effect of BBR on LPS-induced lung platelet retention in TCP mice

3 讨论

脓毒症是由感染引起的反应失调而出现致死性的器官功能障碍，是危重症患者死亡的主要原因之一［6］。血小板减少则是脓毒症患者常见的并发症，研究表明血小板减少程度与脓毒症患者的预后不良具有相关性［7］。脓毒症伴血小板减少患者的病情通常较不伴血小板减少的患者更重，虽然随着医疗科技及高效综合管理的不断更新，脓毒症患者的病死率已有所改善，但脓毒症相关性血小板减少的发病机制仍未阐明，人们对脓毒症相关性血小板减少患者的治疗仍需进一步的研究和改进。

黄连素作为传统中药，由来已久，古书记载其不仅具有清热解痛、除胎毒、防斑疹的作用，还具有清涤血热，去心之恶血之疗效。近年来研究［8］表明，黄连素具有一定的抗内毒素作用，能抑制LPS的促凝血作用，但黄连素对LPS诱发的血小板减少尚未见报道。为探究黄连素是否对LPS诱发的血小板减少有影响，本研究采用了黄连素预处理小鼠及野生小鼠用LPS单次腹腔注射法诱导小鼠TCP模型，观察记录各组小鼠的一般状况及72 h内的生存率并检测LPS注射后小鼠外周血中血小板各项参数和炎症因子的变化情况，以及收集小鼠肺脏组织检测肺脏内血小板的滞留情况。

实验结果显示黄连素能够在一定程度上缓解LPS给小鼠带来的伤害，能够有效地改善LPS刺激后小鼠的生存率。血小板参数检测结果提示黄连素能够抑制LPS诱导的血小板减少，并且黄连素的这一作用呈剂量依赖性。除此之外，黄连素还可抑制LPS诱发的外周血中TNF-α、IL-1β、IL-18水平的升高，在一定程度上缓解机体的炎症反应。肺组织免疫组化结果提示黄连素能够减少LPS诱发的血小板在肺脏中的滞留，并且还能够在一定程度上改善LPS引起的肺损伤。这些观察、检测结果均表明黄连素对LPS诱发的小鼠TCP模型具有一定的保护作用，黄连素可通过抑制LPS引起的血小板减少、炎症反应以及血小板在肺脏中的滞留来减轻LPS对小鼠机体带来的损伤，但其具体作用机制仍需进一步研究。