UFLC法同时测定厚朴中4个活性成分的含量

关 皎，于洋洋，冯 波，朱鹤云

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

厚朴始载于《神农本草经》，列为中品，原文记载“厚朴主中风，伤寒，头痛，寒热，惊悸气，血痹，死肌，去三虫”。2015版《中国药典》记载厚朴(MagnoliaeOfficinalisCortex)为木兰科植物厚朴MagnoliaoffcinalisRend. et Wils.或凹叶厚朴MagnoliaoffcinalisRend. et Wils. var.bilobaRehd. Et Wils.的干燥干皮、根皮或枝皮，具有燥湿消痰，下气除满的功效[1]。厚朴为我国传统中药材，主要分布于四川、湖北、浙江、贵州、湖南等地区。厚朴中主要含有酚类、生物碱类、苯丙醇苷类、挥发油类成分，其中和厚朴酚与厚朴酚为厚朴中两种代表性酚类成分，木兰花碱为厚朴中代表性生物碱类成分，紫丁香苷为厚朴中代表性苯丙醇苷类成分[2]。现代研究表明，和厚朴酚与厚朴酚具有抗菌、消炎、抗肿瘤、肌肉松弛、抗焦虑、降胆固醇和抗衰老等作用[3]，木兰花碱具有抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗菌等作用[4]，紫丁香苷具有抗炎、镇痛、降血糖、免疫调节、保肝等作用[5]。2015年版《中国药典》仅将和厚朴酚与厚朴酚作为厚朴药材质量控制的指标性成分，采用高效液相色谱法测定其含量，难以全面控制其内在质量。近年来，超快速液相色谱(Ultra-fast liquid chromatography, UFLC)技术由于在峰容量、分离效率、灵敏度方面均优于常规 HPLC，并可在极短的时间内达到柱平衡或重新平衡，显著减少分析时间，减少溶剂消耗，已越来越多的应用于中草药成分分析研究[6-7]。本研究首次采用超快速液相色谱法同时测定厚朴中和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱和紫丁香苷的含量，所建立的定量分析方法分析时间短，分析效率明显提高，可为厚朴的质量评价提供科学依据，同时为天然药物应用于兽医兽药领域提供参考。

1 仪器与试药

Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(配备Prominence SIL-20AHT自动进样器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；XK96-A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)；KQ-250DE型数控声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA 225D型电子天平(德国赛多利斯仪器有限公司)；粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

甲醇和乙腈为色谱纯(美国Fisher科技)，所用水为经过Milli-Q型超纯水仪净化后的超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品和厚朴酚(批号：110730-201614)、厚朴酚(批号：110729-201714)、紫丁香苷(批号：111574-201605)，购自中国食品药品检定研究院，对照品木兰花碱(批号：17020802)，购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。厚朴药材，购自吉林市吉林大药房，产地为四川省，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定为木兰科植物厚朴Magnoliae Officinalis Cortex的干燥干皮、根皮或枝皮，样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 取和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷对照品适量，精密称定，置5 mL容量瓶中，用甲醇配成质量浓度分别为1.0、1.0、0.1 mg/mL和0.1 mg/mL的单一成分对照品储备液，置于4 ℃冰箱内保存备用。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取厚朴药材粉末0.2 g(过40目筛)，置50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称重，超声(功率250 W，频率50 kHz)处理30 min，冷却至室温，称重，用甲醇补足减失的重量，振摇均匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，精密量取续滤液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，振摇均匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 采用日本岛津公司Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm)，预柱为日本岛津公司C18保护柱(4 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流动相为0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～7 min，20%B；7～7.1 min，20%→78%B；7.1～16 min，78%B)，平衡时间为2 min，流速为0.4 mL/min，检测波长为265 nm，柱温为30 ℃，进样量为5 μL。和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱和紫丁香苷用于含量测定的典型色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、样品(B)色谱图1：木兰花碱(Magnoflorine)； 2：紫丁香苷(Syringin)；3：和厚朴酚(Honokiol)； 4：厚朴酚(Magnolol)

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下的各对照品储备液适量，置于同一5 mL量瓶中，用甲醇-水(20∶80，v/v)配制成木兰花碱与紫丁香苷质量浓度均为0.2、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL，和厚朴酚与厚朴酚质量浓度均为2、5、10、25、50、100 μg/mL的系列混合对照品溶液；取混合对照品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，按“2.3”项下条件依次进样测定色谱峰面积，以对照品质量浓度X(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的线性回归方程分别为：Y=2.314×104X-1.281×104，R=0.999 9；Y=2.089×104X-9.021×104, R=0.999 8；Y= 2.417×104X-1.083×103, R=0.999 9；Y=3.124×104X-7.905×102, R=0.999 9；上述4个成分质量浓度分别在2～100、2～100、0.2～10、0.2～10、μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.4”项下制备的和厚朴酚质量浓度为25 μg/mL，厚朴酚质量浓度为25 μg/mL，木兰花碱质量浓度为2.5 μg/mL、紫丁香苷质量浓度为2.5 μg/mL的混合对照品溶液 200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上。按上述色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷峰面积的RSD分别为0.6 %、0.4%、0.7 %、0.6%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，在室温下分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12 h和24 h 进样测定，记录峰面积。结果和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷峰面积的RSD 分别为2.4%、2.7%、1.8%、2.8%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批厚朴药材样品6 份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液；取供试品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，进样测定，记录峰面积，计算待测成分的含量。结果和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的含量平均值(n=6)分别为1.63%、2.20%、0.229%、0.207%，RSD分别为2.7%、2.6%、1.0 %、2.7%，表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验 精密称取“2.7”项下已测知含量的厚朴药材样品粉末9 份，每份0.1 g，精密称定，分别加入相当于样品中和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷含量的80%、100%、120% 的对照品溶液适量，各3 份。按“2.2”项下的方法制备供试溶液；取供试溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，进样测定，计算和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的回收率和RSD，结果见表1。

表1 厚朴样品中和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的回收率

2.9 样品含量测定 精密称量6 批次厚朴样品，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，进样5 μL，每个供试品溶液进样3次，记录峰面积，采用外标法计算和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的含量。6 批样品测定结果见表2。

3 讨论

表2 厚朴样品中和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的含量 /%

3.1 流动相的优化 孟超等[8]以甲醇-水-磷酸(66∶34∶0.05)为流动相，采用高效液相色谱法同时测定厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的含量，分析时间为20 min。刘明哲等[9]以甲醇-水-醋酸(80∶20∶1)为流动相，建立高效液相色谱法同时测定厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的含量，分析时间为15 min。薛珍珍等[10]以甲醇-醋酸水( pH值3.0)为流动相，建立高效液相色谱法同时测定厚朴样品中4种极性成分木兰花碱、紫丁香苷、木兰苷A 及木兰苷B 的含量，分析时间为40 min。本研究在参考上述文献的基础上，分别考察了甲醇-水、甲醇-0.5%醋酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.5%醋酸水、乙腈-0.1%甲酸水共6种流动相体系，结果表明，甲醇-0.1%甲酸水作为流动相时能够获得较好的分离效果，分析时间仅为16 min，且药材中其他色谱峰不干扰样品的测定。

3.2 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器(DAD)进行全波长扫描，和厚朴酚的最大吸收波长分别为254 nm和291 nm，厚朴酚的最大吸收波长为289 nm，木兰花碱的最大吸收波长为269 nm，紫丁香苷的最大吸收波长为264 nm。综合考虑杂峰影响，基线平稳，色谱峰峰形，最大吸收等因素，本试验选择265 nm作为检测波长。

3.3 提取方法及提取溶剂的选择 本试验对比了回流法和超声法提取厚朴中4个活性成分的提取效果。结果表明，超声提取30 min所得供试品中上述两种活性成分的含量明显高于回流提取法。本试验对比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液对厚朴中4种活性成分的提取效率，结果显示，100%甲醇的综合提取效率最高，故本试验采用100%甲醇作为提取溶剂。

3.4 本研究建立UFLC法,同时测定厚朴中和厚朴酚、厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷的含量，应用该方法测定了6批厚朴中上述4个活性成分的含量。购自吉林大药房的6批厚朴药材均符合《中国药典》2015年版要求(药典规定厚朴中含和厚朴酚与厚朴酚的总量不得少于2.0%)。本研究建立的UFLC方法分析时间短、重复性及稳定性好、专属性强，与《中国药典》2015年版相比，又增加了厚朴中2个有效成分的质量控制方法，可为厚朴的质量标准提升提供一定的参考。