金银花复方制剂对新城疫病毒感染雏鸡免疫器官抗体生成细胞数量的影响

宋洋洋，王洪梅，李天琦，于浩然，刘 微，葛 铭

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省教育厅动物普通疾病防治重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

鸡新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的高度接触性传染病，可感染多种禽类并且在世界各地造成了严重的经济损失。虽然新城疫疫苗在养禽业中广泛应用，未出现新城疫的大范围流行，但很多地区新城疫的免疫程序还不统一，同时新城疫病毒的毒力和免疫原性都在发生变异，导致时常发生局部流行，因此，开发抗新城疫的中草药制剂对防治该病有一定的理论和实践意义。我国中草药资源丰富，有着悠久的应用历史，中草药不仅具有直接杀灭病毒和广谱抗病毒的作用，还能改善动物机体内环境，提高免疫功能。本实验应用免疫酶组织化学法，研究了金银花复方制剂对人工感染NDV雏鸡胸腺、腔上囊、脾脏抗体细胞生成数量变化的影响，为进一步研究开发更有效地防治ND的中兽药制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 金银花复方制剂 金银花、连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草，购自哈尔滨中药大市场。

1.2 病毒 鸡新城疫病毒(MukteswarI系)，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，EID50为10-4.5/0.1 mL。

1.3 实验动物 1日龄海蓝白雏鸡105只，雌雄各半，购自某孵化厂。

1.4 主要试剂 PBS(pH值7.2～7.4)缓冲液(现配)；正常山羊血清封闭液(武汉博士德生物工程有限公司，批号：AR0009)；兔抗鸡IgG(北京博奥星生物技术有限责任公司，批号：bs-0310R)；IgM(北京博奥星生物技术有限责任公司，批号：bs-0314R)；酶标羊抗兔IgG(北京博奥星生物技术有限责任公司，批号：bs-0295G)；DAB显色试剂盒(北京博奥星生物技术有限责任公司，批号：C02-04001)；苏木素(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：TD005)。

1.5 金银花复方制剂的制备 准确称取金银花、连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草各 150 g，先将药物放入不锈钢锅内用清水浸泡1 h，加水量要淹没过药物3 cm，之后用大火将浸泡好的药物煮沸，再改用中、小火维持药物沸腾，继续煎煮20 min，用纱布将药汁过滤收集，再加适量清水继续煎煮，水量淹没过药物即可，煎煮条件同前，沸腾后再煎煮15 min，用纱布过滤药汁，将2次收集的药汁混合浓缩至150 mL，将浓缩液12 000 r/min离心20 min，取上清液，用生理盐水定容至50 mL。

1.6 实验动物分组及处理 105只1日龄海蓝白雏鸡饲养至21日龄，随机抽取15只，翅静脉采血，用琼脂扩散法检测NDV母源抗体为阴性，随机分成3组，即对照组(C组)、NDV感染组(I组)和金银花复方制剂治疗组(T组)。I组和T组雏鸡经眼、鼻、口人工感染NDV，0.2 mL/只。C组雏鸡经相同途径给予相同剂量的PBS。T组雏鸡于感染后6 h饮服金银花复方制剂治疗，剂量为1 mL/只，每天给药1次，给药方式为自由饮水，饮水前3～4 h停水，连续7 d；I组雏鸡为不治疗对照组，在人工感染NDV后不应用任何药物治疗。以上各组雏鸡分别严格隔离饲养。

1.7 采样 各组分别于感染后第1、3、5、7、14、21、28天取材。每组每次随机抽取5只雏鸡，称重，心脏采血，快速采取免疫器官，固定于4 ℃预冷的10%中性福尔马林缓冲液中，常规快速丙酮脱水，石蜡包埋、切片，用于IgG、IgM抗体生成细胞数量测定。

1.8 检测指标及方法 采用免疫酶组织化学法进行检测，一抗为1∶100稀释度兔抗鸡IgG，IgM；二抗为1∶100比例稀释的酶标羊抗兔IgG结合物，最后经DAB避光染色。

结果检查：参考Romppanen的格点计数法，油镜检查单位面积(100 mm2)免疫器官组织的特定区域：胸腺(小叶皮质、髓质)，脾脏(红髓、白髓、淋巴小结)，腔上囊(淋巴滤泡皮质、髓质)周围的IgG，IgM生成细胞数量。单位以103×细胞数/mm2表示。

1.9 数据处理 采用SPSS软件进行数据处理，比较各组差异显著性。

2 结果

2.1 NDV感染及金银花复方制剂治疗后雏鸡腔上囊抗体生成细胞数量的变化 从表1可见，NDV感染21日龄雏鸡后，NDV感染组腔上囊淋巴滤泡皮质IgG生成细胞数于感染后3～5 d明显低于对照组和金银花复方制剂治疗组雏鸡(P<0.05或P<0.01)，IgM生成细胞数分别于感染后5～7 d明显低于对照组和金银花复方制剂治疗组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。NDV感染组雏鸡腔上囊淋巴滤泡髓质IgG生成细胞数分别于感染NDV后5～7 d明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05)，IgM生成细胞数分别于感染后5～14 d明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。

2.2 NDV感染及金银花复方制剂治疗后雏鸡脾脏抗体生成细胞数量的变化 从表2可见，NDV感染21日龄雏鸡后，NDV感染组雏鸡脾脏红髓IgG生成细胞数分别于感染后3～5 d明显低于对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)，IgM生成细胞数分别于感染后5～7 d明显低于对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。NDV感染组雏鸡脾脏白髓IgG生成细胞数于感染NDV后3～7 d明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)，IgM生成细胞数分别于感染后第7～14天明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。NDV感染组雏鸡脾脏淋巴小结IgG生成细胞数分别于感染NDV后5～14 d明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)，IgM生成细胞数分别于感染后第5～7天明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。

表1 NDV感染及金银花复方制剂治疗后雏鸡腔上囊抗体生成细胞数量的变化 (×103/mm2)

注：字母不同者表示差异显著P<0.05;大写字母不同表示P<0.01；小写字母不同表示P<0.05；无标记或字母相同者表示差异不显著，P>0.05,下表同

表2 NDV感染及金银花复方制剂治疗后雏鸡脾脏抗体生成细胞数量的变化 (×103/mm2)

2.3 NDV感染及金银花复方制剂治疗后雏鸡胸腺抗体生成细胞数量的变化 从表3可见，NDV感染21日龄雏鸡后，NDV感染组雏鸡胸腺皮质IgG生成细胞数于感染后3～5 d明显低于对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)，IgM生成细胞数分别于感染后3～7 d明显低于金银花复方制剂治疗组和对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。NDV感染组雏鸡胸腺髓质IgG生成细胞数分别于感染后3～5 d明显低于对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)，IgM生成细胞数分别于感染后5～7 d明显低于对照组雏鸡(P<0.05或P<0.01)。

表3 NDV感染及金银花复方制剂治疗后雏鸡胸腺抗体生成细胞数量的变化 (×103/mm2)

3 讨论

本试验所应用的金银花复方制剂主要由金银花、连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草等组成，该方以抑制病毒的金银花、连翘、鱼腥草为主药，以增强免疫功能的黄芪、白术为辅药，配以甘草调和药性。有学者研究表明，金银花、连翘具有显著的抗病毒、抗炎和抗氧化作用；鱼腥草具有抗病毒和增强免疫的作用；黄芪能促进动物淋巴细胞转化率、促进未成熟的T淋巴细胞转化并提高其活性，增强机体免疫力；白术能促进T淋巴细胞增殖、分化，改变T细胞亚群比例；甘草具有补脾益气，和中缓急，缓解药物毒性调和诸药的作用[3-5]。

3.1 金银花复方制剂对 NDV 感染雏鸡免疫器官IgG生成细胞数的影响 IgG主要是由脾和淋巴结中的浆细胞合成，是产生体液免疫应答的主要抗体，具有调理吞噬、凝集、沉淀抗原、中和病毒和毒素、激活补体传统途径的作用[6]。本试验测定雏鸡腔上囊、胸腺、脾脏免疫器官中IgG生成细胞的数量，结果发现，雏鸡感染NDV 3～5 d时IgG生成细胞的数量显著低于对照组，提示NDV对IgG生成细胞具有严重的损伤作用，后期数量回升，表明雏鸡免疫器官逐渐发育完善，免疫功能逐渐增强。本试验的另一部分试验表明，金银花复方制剂能有效的提高外周血液中IgG的含量[7]，结果与本试验结果对比可以发现，IgG含量的提高与金银花复方制剂对免疫器官中IgG生成细胞的保护有关，说明金银花复方制剂可以有效地对抗NDV对IgG生成细胞的损伤。NDV对免疫器官中IgG生成细胞的损伤可能与诱导其凋亡有关，在本试验的另一部分试验中观察到腔上囊等免疫器官的萎缩现象，提示金银花复方制剂对NDV降低IgG生成细胞数的治疗机制可能是抑制NDV诱导的凋亡，并且和能够提高T淋巴细胞和B淋巴细胞的数量有关。

3.2 金银花复方制剂对 NDV 感染雏鸡免疫器官IgM生成细胞数的影响 IgM是B淋巴细胞表面最早表达的抗体，属于五聚体，是最高效的抗体，具有杀菌、溶菌、溶血、促进吞噬及凝集作用。本试验中，雏鸡感染NDV后，免疫器官中IgM抗体生成细胞数显著低于对照组，表明NDV可降低免疫器官抗体生成细胞数，NDV感染雏鸡体液免疫水平下降。感染后期，免疫器官抗体生成细胞数量回升，可抵抗病毒感染。雏鸡感染NDV后，腔上囊有不同程度的出血、充血、萎缩等病变[8]。提示NDV对腔上囊有损害作用，导致B细胞发育和分化场所被破坏，从而降低了免疫球蛋白生物合成，抑制了鸡的体液免疫功能。金银花复方制剂治疗组雏鸡腔上囊、脾脏及胸腺IgM抗体生成细胞数均于感染后第5天或第7天不同程度的回升，并且于感染后3～28d不同程度的高于NDV感染组雏鸡，表明金银花复方制剂对NDV导致的免疫器官IgM抗体生成细胞数量的减少有显著的抑制作用，可能与金银花复方制剂能够促进抗体合成，提高机体体液免疫功能从而在初期起到抗病毒的作用，并且与金银花复方制剂能有效的提高B淋巴细胞的合成数量有关。

本试验结果表明，复方金银花制剂具有显著的提高雏鸡免疫器官抗体生成细胞数量，具有增强免疫功能的作用。