貂源绿脓杆菌山东分离株exoA-fliC基因的原核表达及其免疫原性研究

秦晓冰，马凤芹，单 虎

(青岛农业大学 山东省预防兽医学重点实验室，山东 青岛 266109)

绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌(PA)，属于假单胞科假单胞属。PA可以引起水貂出血性肺炎，该病以肺部肿胀、出血为主要特征，是一种严重威胁养貂业的急性传染病[1-2]。PA为条件性致病菌，存在于污染的水、饲料、环境及患病动物排泄物等，能经口、鼻途径感染水貂[3]。水貂发生PA感染，往往会使用抗生素治疗，但因PA的多重耐药常致使药物治疗失败。因此，寻找新的PA防治方法势在必行。

目前，PA的鞭毛、纤毛、外膜蛋白、毒素等不同抗原和毒力因子有望开发成亚单位疫苗来防治该传染病[4-5]。PA的外毒素A(exoA)可通过灭活延伸因子2来阻碍蛋白质的合成，具有抑制宿主对感染产生反应的能力；还可诱导动物模型产生免疫应答，生成保护性抗体，exoA被誉为预防PA感染极有前途的一种疫苗源[6]。PA的鞭毛可以与Toll5受体相互作用，诱导炎症反应，而且不同血清型PA间具有相同的鞭毛蛋白，能起到交叉保护作用。fliC 基因是鞭毛蛋白的主要基因，由于有良好免疫原性，常被选为疫苗源进行研究[7-8]。

单一抗原不能产生持久的保护性免疫，含有不同抗原的疫苗却能发生高水平免疫应答[9]。本试验利用山东省水貂PA分离株，对其exoA和fliC蛋白进行了融合表达并对其免疫原性作了研究，旨在开发出安全高效的基因工程疫苗，为有效预防与控制水貂PA的感染开辟一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料 水貂PA致病性分离株(PASD01菌株)、绿脓杆菌标准菌株ATCC27853，均由山东省预防兽医学重点实验室提供。昆明系小鼠，购自青岛派特福德养殖专业合作社。

ExTaqDNA聚合酶及其他工具酶、DL-5 000 DNA Marker、pMD-19T，购自大连TaKaRa公司；X-gal、IPTG，购自北京索莱宝科技有限公司；UNIQ-10 柱式DNA回收试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 引物 根据GenBank登录的PAO1exoA基因和8821MfliC基因，设计两对引物(见表1)，引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，预期产物长度exoA基因为1 212 bp，fliC基因为510 bp。

表1 用到的引物

注：下划线部分为酶切位点

1.3 目的基因的扩增 菌株PASD01细菌液为模板，用exoA-F和exoA-R进行exoA(I区+II区)扩增；以fliC-F和fliC-R进行fliC 扩增。PCR体系(25 μL)：10×PfuBuffer with MgSO42.5 μL，dNTP Mix 2 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，PfuDNA polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，基因组DNA 1 μL，DMSO 1 μL，40%甘油3 μL，ddH2O 14.25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，68.2 ℃(exoA)或57.9 ℃ (fliC)1 min，72 ℃ 3 min(exoA)或2 min(fliC)为一个循环，共30个循环，72 ℃延伸20 min。扩增exoA-fliC基因，25 μL体系用引物(20 μmol/L)exoA-F、fliC-R各0.5 μL，分别用exoA 扩增产物4 μL、fliC 扩增产物1 μL作用模板，并加入DMSO μL 和40%甘油4 μL。反应程序同上，用1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定后回收。

1.4 原核表达载体的构建与诱导表达 将exoA-fliC基因与pMD19-T载体连接，转入E.coliDH5α感受态细胞，筛选阳性克隆载体pMD19-T-exoA-fliC。将其与表达载体pET30a分别经BamH I、XhoI双酶切，胶回收后16 ℃连接过夜，转到DH5α 感受态细胞后，PCR、酶切鉴定后送华大基因科技服务有限公司测序。测序后，表达载体经IPTG诱导表达，培养相应的重组菌，离心、洗涤、悬浮，超声破碎，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE。用 HisTrapTMHP固定化金属配体亲和层析柱纯化超声破碎沉淀，纯化、尿素复性，透析后，再SDS-PAGE电泳分析，BCA试剂盒测定其浓度。

1.5 表达蛋白的Western Blot分析 复性后的表达蛋白分别以兔抗水貂PA阳性血清和兔抗水貂PA鞭毛蛋白血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，ECL Plus发光液加到PVDF膜上，X线片夹中曝光。

1.6exoA-fliC嵌合蛋白免疫小鼠及间接ELISA检测 向exoA-fliC嵌合蛋白复性液加等体积弗氏不完全佐剂，混合乳化，50 μg/只皮下多点免疫昆明系小鼠，于第3周和第6周各加强免疫1次，共免3次，同时设立PBS对照组。第三次免疫后7 d，挖眼眶采血。以兔抗水貂PA鞭毛蛋白阳性血清和阴性血清为一抗，采用棋盘法确定exoA-fliC嵌合蛋白的最佳包被浓度。利用间接ELISA方法测定抗体效价，复性的exoA-fliC嵌合蛋白包被酶标板，加10 000倍稀释血清，倍比稀释，酶标仪测定OD450值。

2 结果

2.1 目的基因的扩增exoA和fliC基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段分别1 212 bp和510 bp，与预期相符(图1)。重叠PCR得到的exoA-fliC基因，片段为1 722 bp，与预计相符(图2)。

图1 exoA、fliC基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳

图2 重叠PCR产物琼脂糖凝胶电泳

M：DL-5 000 DNA分子量标准； 1～2：exoA-fliC

2.2 表达质粒的鉴定 重组质粒pET30a-exoA-fliC经PCR扩增得到1 722 bp的条带，BamHI、XhoI双酶切获得5 422 bp和1 722 bp左右的片段，均与预期相符(图3)，重组表达载体构建正确。

图3 重组表达质粒pET30a-exoA-fliC鉴定

M：DL-5 000 DNA分子量标准； 1：重组表达质粒双酶切产物； 2：重组表达质粒

2.3 IPTG诱导时间与诱导浓度的确定 将诱导表达菌裂解后进行SDS-PAGE分析，经考马斯亮蓝染色，在蛋白质相对分子质量约68 kDa的位置上有表达明显的目的条带，诱导开始后，exoA-fliC嵌合蛋白的表达逐渐增多(图4)，经BandScan5.0分析IPTG诱导7 h达到高峰。不同浓度IPTG均可诱导exoA-fliC蛋白的表达，经分析IPTG终浓度为0.8 mmol/L时exoA-fliC蛋白的表达量最高。

图4 不同诱导时间对蛋白表达的影响

M：蛋白质分子量标准； 1：IPTG诱导8 h的空载体pET-30a；2～9：经IPTG诱导1，2，3，4，5，6，7 h和8 h的转化菌菌体裂解物

2.4 嵌合蛋白exoA-fliC表达形式分析、纯化及Western Blot分析 将诱导的菌体经破碎离心后，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，exoA-fliC蛋白主要位于沉淀中，表明该蛋白主要以包涵体的形式存在。沉淀经亲和层析纯化，分析后确定蛋白纯度约为85%。分别用兔抗水貂绿脓杆菌鞭毛蛋白血清及兔抗水貂绿脓杆菌阳性血清作为一抗对重组蛋白进行Western Blot检测，在约68 kDa处均出现特异性条带(图5)，表明原核表达产物正确，具有良好的反应原性。

图5 exoA-fliC的表达形式、纯化及Western Blot分析

M：蛋白分子量标准； 1～2：重组菌破碎后上清与沉淀；3：重组菌表达总蛋白； 4～5：蛋白纯化产物；6～7：不同一抗的重组蛋白Western Blot

2.5 ELISA检测多克隆抗体效价 选择5 μg/mL的exoA-fliC嵌合蛋白为包被浓度，阳性血清的OD450值(P值)最接近1.0，阴性血清OD450值(N值)较低，P/N值较高。通过ELISA检测多克隆抗体的效价可达1∶640 000(图6)。

3 讨论

图6 ELISA法测定exoA-fliC多克隆抗体效价

本试验用exoA-fliC重组蛋白作为预防水貂PA感染的候选疫苗，既克服了天然外毒素和鞭毛蛋白直接提纯的困难，又保证二者构象不发生改变，保持其天然的免疫学特性。采用基因工程方法，不仅使蛋白大量表达成为可能，而且删除这两个基因的不必要区域而瞄准保守区和免疫原性区。本研究扩增1 212 bp外毒素A Ⅰ区+Ⅱ区(编码外毒素A404 N末端氨基酸)，删除其具有细胞毒性的Ⅲ区。这样既保留其大部分抗原性，能诱导针对PA中毒的免疫保护作用，又因删除毒力基因而使其具有安全性；对于鞭毛蛋白基因，仅扩增编码鞭毛蛋白N末端170氨基酸保守序列的510 bp基因片段，用于融合表达及蛋白生产。

本试验利用重叠延伸PCR方法制备exoA-fliC融合基因，巧妙地将来源不同的扩增片段拼接起来，无需限制性内切酶的消化和连接处理，也无任何目的基因以外的其他序列掺入，展示出重叠PCR简便、高效、快速、易于操作等优点。为基因工程亚单位疫苗防治水貂PA开辟了新思路。