糖芯片的制备和检测应用研究进展

顾 锐, 胡 静, 尹 健*

1.江南大学生物工程学院, 糖化学与生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122;2.江南大学无锡医学院, 江苏 无锡 214122

糖是生命系统中的重要组成部分，广泛存在于生物体中，几乎每个活细胞表面都修饰着高度多样化的糖复合物[1]，它们在生物学识别和生物信息传递中起着至关重要的作用，例如糖结合蛋白对细胞识别、黏附和信号传导的调节作用[2,3]、介导病原菌的感染作用、引起相应的免疫应答作用[4～6]，以及糖物质在肿瘤转移、炎症发作等病理过程中的关键作用[7]。因此，在分子基础上研究糖介导的相互作用，深入了解相关机制和过程，在生物医药和临床诊疗研究中具有重要意义。

自Ekins[8]首次提出生物芯片技术的概念，DNA芯片和蛋白质芯片技术已发展成为广泛应用的生物分析工具[9]。2002年Wang等[10]首次报道将糖探针固定于硝酸纤维素包被的玻板上制备糖芯片。其后，随着糖科学的发展，糖芯片技术迅猛增长[11,12]，正逐步成为应用于糖生物学和糖组学的重要技术。糖芯片的基本原理是将具有确定结构的糖或糖复合物固定于特定载体上，根据待测样品与之杂交后的信号，分析糖介导的特异性结合作用及样品的结构特点等。糖芯片检测中检测样品用量少、灵敏度高，可实现高通量操作，目前多用于鉴定疾病相关的抗糖类抗体的检测和定量分析、糖类与蛋白结合特异性的分析[11,13]、检测病原体和筛选药物作用靶标[14]等多个领域。因此，本文介绍了通过糖库的制备、载体的选择、非共价结合和共价吸附等方法构建糖芯片，并对糖芯片的检测技术和其在生物学和生物医学领域的应用进行了综述，如检测糖-蛋白之间相互作用、药物开发和临床诊断中的应用，最后对糖芯片技术的发展进行了展望。

1 糖结构库的制备方法

构建糖芯片的关键因素之一是合成糖库，由于糖结构复杂，难于合成，导致糖库可用于构建糖芯片的糖数量有限[15]，目前的糖库主要包括天然的寡糖、液相合成或自动化固相合成的寡糖、多糖、糖蛋白和糖脂等[16]。

1.1 天然聚糖分离

天然糖库的糖由天然来源分离得到，通常步骤是[17]：从细胞、组织、病原体、乳汁、尿等来源中分离出含糖混合物；在含糖混合物上衍生出连接臂或荧光标签，用于后续的纯化、分离和固定[18,19]；进一步分离得到含有不同糖结构的亚组分。此方法可以以特定细胞、组织为对象分离特定糖，但衍生步骤会降低糖得率，也不易对糖进行结构鉴定。因此，需要设计选择有效且可靠的衍生方法、分离纯化技术以及鉴定和表征未知糖结构的方法[20,21](图1)。天然糖库的发展极大地拓展了糖类结构的多样性，增加了通过糖芯片检测获取的生物信息。

1.2 化学合成法

还有一些天然糖结构，由于量少不易分离，可通过化学或化学酶合成的方法获得。化学合成糖的过程中，糖苷键的合成是关键；而糖环上有羟基等活性基团时，需要对糖基受体采取保护策略并引入保护基团，在糖基供体的还原端还要有合适的离去基团(图1)。近数十年间，糖的合成研究取得了很大的进展，如Ye等[22]首次全合成了高度分支化、由92个单糖单元所组成的阿拉伯半乳聚糖，是目前所合成的最大、最复杂的均一结构的多糖分子。但是要合成确定序列的寡/多糖还有很大难度。为了快速构建糖库，目前开发了一些自动化合成复杂寡糖的方法[16,23,24]，如固相自动合成和可编程的一锅法寡糖合成。固相自动合成寡糖主要先将首个单糖连接到固相载体上，再通过系列的连接臂糖基化反应将不同单糖单元依次连接形成所需合成的寡糖。例如Seeberger等[23]结合固相合成法和传统液相合成法构建了硫酸肝素聚糖、糖基化磷脂酰肌醇探针和高甘露糖型寡糖糖库。可编程的一锅法寡糖合成法通过程序将合适的糖基供体和受体砌块按顺序加入反应器并组装出所需的寡糖。Wong等[24]用这种方法构建了糖抗原Globo-H相关寡糖的糖库。目前，自动化合成法主要用于合成特定的寡糖，还需要大量的糖砌块，限制了其广泛应用。

1.3 化学酶合成法

化学酶合成法也多被用于合成糖库[25,26]，使用适当的糖基转移酶将活性供体的单糖或寡糖转移到糖受体，利用不同的酶可延伸糖链至最终产物(图1)。其优点是不需引入保护基控制糖苷键形成的区域和立体异构性，避免了化学合成中许多保护和脱保步骤。通过酶法可以获得难以化学合成的寡糖，例如唾液酸通过唾液酸转移酶可以很容易地连接[27]。但许多哺乳类糖基转移酶对底物和受体特异性有严格要求，因此仅能应用于天然糖结构亚单元的合成[28]。还需要探索其他来源的糖基转移酶来获得更为灵活的供体和受体特异性的转移酶[29]。

图1 构建糖库的常用方法Fig.1 Common methods for carbohydrate libraries building.PG:保护基团;LG:离去基团;GT:糖基转移酶

糖结构和连接方式具有极大的多样性，需要大量不同的糖基供体和不同的反应条件，因而很难通过一种通用的方法来合成寡糖。目前所构建的糖库数量还比较有限，因此还需要结合分离天然聚糖方法和合成糖链的方法来合成更多特定糖结构，从而促进糖芯片技术的应用和发展。

2 载体的分类

用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以不溶于水的状态行使功能的固相材料统称为载体。理想的载体材料通常要求具有可与糖分子进行结合的表面，同时又具有足够的惰性、稳定性以及良好的生物兼容性。载体一般分为活性表面载体和非活性表面载体。对载体表面不进行任何化学修饰的载体称为非活性表面载体，常见的非活性表面载体有硝酸纤维素膜、聚苯乙烯微孔板、尼龙膜和玻璃片等。与非活性表面的结合主要以疏水作用为主，少数依靠物理吸附、静电作用、亲水作用和氟-氟相互作用[15]等物理结合方式。这类结合比较微弱，要选择适合的缓冲液和洗涤条件，确保糖分子保留在载体表面。但单糖和寡糖分子量低、亲水性好，不能直接以非共价结合的方式固定，需经过修饰后和载体结合。

活性表面载体是指载体表面经化学修饰出氨氧基、酰肼、巯基等基团，可形成较为稳定的特异性共价键，且糖分子能规整地排列，可与待测样品高效作用[13]。常见的活性表面载体有金箔、聚吡咯膜、玻璃片和硅片等，其中玻璃片是最常用的载体。硅片表面与玻璃片相比，具有埃米级的平整度、良好的化学稳定性以及良好的生物分子相容性，可以有效的降低载体的非特异吸附。Shirahata等[30]用质子化硅片制备的糖芯片与蓖麻凝集素的结合效果与聚乙二醇单分子层改性的玻璃片相当，但是制备工艺更简单，具有广泛的应用前景。

3 固定化方法

将糖有效的固定在载体表面是成功制备糖芯片的必要条件。理想情况下糖整齐地排列在载体表面，呈现合适的三维结构，与相应的生物分子结合。根据芯片载体和糖结构的不同，糖的固定化方法主要分为两大类：非共价固定和共价固定。

3.1 非共价固定法

3.1.1非位点特异性的非共价固定 直接将糖以非共价结合的方式例如氢键和疏水作用等物理作用固定到载体表面，其中糖和载体的连接不存在位点选择性。2002年，Wang等[10]首次报道将多糖非共价固定于硝酸纤维素膜上。Willats等[31]则将多糖通过氢键和疏水作用直接固定在经过氧化处理的聚苯乙烯上(图2A)。以上研究中，多糖在非共价固定后都保留了各自抗原性，可应用于筛选不同抗体。未修饰的肝素多糖通过静电作用非特异吸附在带有正电荷的葡聚糖胺基玻片上制成多糖芯片[32](图2A)。这种固定方法适用于多糖、糖蛋白、糖脂等糖类大分子，而单糖和寡糖分子量低，此类非共价结合微弱。

3.1.2位点特异性的非共价固定 单糖和寡糖分子可经修饰后通过特异性非共价结合固定于载体上。例如，Feizi等[33]通过疏水作用将脂质修饰的寡糖吸附在聚偏氟乙烯和硝酸纤维素膜包被的载体上用于检测糖和蛋白的相互作用(图2B)。Lin等[34]将C8F17-基团连接到糖分子末端羟基上，然后通过氟-氟之间的特异性结合作用连接于含氟的载体表面，而且氟标记的糖容易通过氟柱分离(图2C)。Levery等[35]将氟标记的糖固定在C8F17-磷酸盐衍生的氧化铝涂层表面用于研究糖-蛋白质的相互作用。这种固定方法可以直接通过质谱法对非共价结合的糖进行分析。

利用生物素(biotin)和链霉抗生物素蛋白(streptavidin)的亲和作用力也可以制备糖芯片[36]，可将修饰生物素基团的寡糖固定到链霉抗生物素蛋白包被的载体表面(图2D)。DNA杂交技术也被用于糖芯片的构建[37]，将序列结构明确的DNA单链作为锚链与糖探针连接，再通过DNA互补链之间的配对，固定于连接互补链的载体上(图2E)。

在非共价固定过程中，糖分子在载体表面的取向不能完全一致，可能影响部分糖与待测分子间的有效结合，降低糖芯片的灵敏度。

图2 非共价固定法Fig.2 Noncovalent immobilization methods.A.未修饰的多糖或肝素多糖附着在载体上；B.将糖脂附着在载体上；C. 氟标记的糖固定在氟烷基活化表面；D. 生物素连接的糖结合到载体上；E. 寡核苷酸连接的糖固定到互补链修饰的载体上

3.2 共价固定法

糖或载体经过化学修饰，通过共价固定方法，使糖特异性且取向一致地排列在修饰后的载体上，从而提高糖芯片检测的灵敏度和选择性。

3.2.1位点特异性的共价固定 糖芯片制备的最常用方法是将化学修饰的糖与载体表面通过共价键相连，这类固定方式更加稳定、特异性更高。糖和载体间连接臂的性质和长短可能影响糖和样品的结合。例如，亲水性聚乙二醇连接臂比疏水性的连接臂更有利于糖探针与蛋白的结合[38]。Shin等[39,40]最早利用该固定方法合成糖的马来酰亚胺基化合物，通过Michael加成反应到硫醇修饰的载体表面，或将含硫醇的糖固定在马来酰亚胺修饰的载体表面[41,42](图3A)。Seeberger研究小组利用这类糖芯片研究藻青菌中分离蛋白与甘露糖的相互作用[43]。另外，二硫键也被应用于糖芯片的构建，如用硫代硫酸盐和巯基修饰的糖固定到巯基和吡啶基二硫基的载体表面[44,45](图3B-C)。但是在糖芯片构建时要注意巯基容易被氧化。

其他很多化学反应被应用于糖芯片的制备。例如，通过Diels-Alder反应将连接环戊二烯基团和亲二烯体基团的糖用于糖芯片的制备。Houseman等[46]的研究表明,连接环戊二烯基团的糖可以固定在含有苯醌基团的载体上。Beckmann等[47]将连接亲二烯体基团的糖通过逆电子Diels-Alder反应固定到四嗪基团的表面(图3D)。还有将连接氨基的糖固定在三聚氯氰修饰的载体表面[48](图3E)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的表面[3,17,32](图3F)。醛基和氨基或氨氧基之间的反应也可应用于糖芯片的制备，例如将氨氧基连接的软骨素寡糖[49]或低聚肝素[32]固定在含醛基或者氨基载体表面(图3G)。酰肼和环氧化合物之间的选择性连接也被用于糖芯片的制备[50,51](图3H)。

图3 位点特异性的共价固定Fig.3 Covalent site-specific immobilization.A,B,C:基于硫醇的化学反应制备糖芯片；D:利用Diels-Alder或逆电子的Diels-Alder反应制备糖芯片；E,F,G,H:基于氨基的化学反应制备糖芯片；I,J,K:基于叠氮基的化学反应制备糖芯片

基于叠氮基的糖芯片固定主要利用两类反应方法，一是通过点击化学(click chemistry)的原理，使分别修饰炔基和叠氮基的糖和载体表面由Cu(I)催化发生环加成反应相连[52](图3I)。另一类利用施陶丁格(Staudinger)反应，其中叠氮基和膦可以选择性结合，但与点击化学方法相比不需要金属催化[53](图3J)。还有将4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯基修饰到糖分子端基位后，通过光化学反应固定到聚合物单分子膜表面[54](图3K)。

3.2.2非位点特异性的共价固定 由于糖的合成、分离和纯化繁琐，且产率不高，不易于再化学修饰。如果直接利用糖的还原端半缩醛与载体表面共价结合，可提高效率，简化工作。这种方法开发较少，目前主要的方法是将未修饰的糖固定在修饰有光反应基团的载体上，如芳基三氟甲基二氮杂环丙烯[55]、4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯基[56]、邻苯二甲酰亚胺[57]等基团。前两个光反应基团在光的照射下迅速转化成高反应活性的卡宾(carbene)和氮宾(nitrene)，再通过插入反应实现与糖的共价结合(图4A、B)。或在邻苯二甲酰亚胺修饰的表面，在紫外光的照射下产生高活性中间体后与糖共价结合(图4C)。近期，Hsiao等[58]报道了一个基于硼酸与1,2-或1,3-二羟基糖(如葡萄糖、果糖等)络合的新方法(图4D)。

3.3 其他固定方法

最近Rubina[59]提出了三维糖芯片(3D Array)的概念，在基质表面带有疏水作用的基团，探针包裹在凝胶微球中并通过其空间立体结构呈三维分布，因而比普通芯片存在更好的结合方式和更多的结合位点，同时也能够提高芯片的结合效率和检测灵敏度。三维芯片的载体材料有凝胶、无机或有机纳米颗粒等，具有操作简便、负载量大、灵敏度高等优点，有巨大的开发潜力。Liu等[60～63]开发了一种球形聚合物分支纳米结构基体，提供了更好的生物大分子的负载量和靶向性。Ke等[64]通过自组装形成具有蜂巢状的一种两性嵌段共聚物以修饰糖基单体，制成三维糖芯片，其形成的树状结构高度支化内部有孔隙，且表面堆积致密，分子尺寸达纳米级，大部分羟基都位于内部孔隙，可提供表面修饰的定向位点。与二维芯片相比，三维芯片在检测生物大分子的作用上表现出优异的能力，在未来糖芯片检测上具有巨大的应用潜力和价值。

4 糖芯片的检测

糖芯片在与待测样品结合后，理想的检测方法应具有高灵敏度，并可用于定量和高通量分析。目前的检测方法有荧光检测法、表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术、质谱法以及同位素标记检测法[65～68]。常用的是荧光检测法[69]，通过直接或间接检测样品的荧光信号，其特点在于操作方便、检测灵敏度高、定位功能强，还可以进行定量分析和高通量筛选。但也有一些限制，如待测样品需加上荧光标记，但标记反应可能影响样品与糖的结合，且标记分子自身的性质也会受到一些限制。大多数的荧光基团对光敏感且易氧化分解，所以信号强度会受时间等影响而不够稳定。同位素标记法也是一种高灵敏度、高通量的检测手段，一般用于阵列密度较小的芯片。但是该方法污染较大，检测时信号可能互相干扰，也不宜广泛应用。

SPR技术利用物理光学原理，适合检测具有较低亲和力的配体和受体的相互作用，具有可实时监测生物分子的相互作用和无需标记两大优点[68]。该技术为糖芯片的应用提供了一种有力的检测糖与蛋白之间特异性作用的工具。另外，质谱检测法也不需标记样品，灵敏度高，但是不能实现高通量分析，目前也是研究糖链结构的工具之一。

5 糖芯片的应用

细胞表面的多糖和糖复合物在很多生物过程中具有重要作用，也可能成为相关疾病治疗过程中的重要靶标。糖芯片技术多被用于功能性糖组学和糖结合配体检测的研究，并逐渐在新疫苗开发、临床诊断方法的研究与开发中发挥越来越重要的作用[5,14,70]。

5.1 糖芯片在检测糖-蛋白质相互作用中的应用

糖芯片技术主要应用于快速和高通量地分析糖和蛋白质的相互作用，并可用于鉴定未知糖结合蛋白或鉴定和表征未知多糖的结构[13,71]。

目前，糖芯片已经成为快速鉴定凝集素及其特异性的主要工具[72,73]。细胞表面凝集素与其糖配体结合所介导的细胞间相互作用参与了许多细胞生物体的有序发育和正常运转的重要生物进程[72]。目前糖芯片已经成为鉴定凝集素特异性的主要方法之一[51,72]。Pond等[38]报道将糖功能化的囊泡固定在硝酸纤维素玻片上，为研究其他未知凝集素的功能提供了可能。Nimrichter等[48]制备的寡糖芯片显示原代鸡肝细胞表面表达C型的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合的凝集素，因为这类细胞仅与非还原性末端GlcNAc吸附，而不吸附半乳糖和N-乙酰半乳糖胺。

生物体内的一些酶与糖的结构和合成效率都有密切关联，明确其底物特异性有利于开发酶的催化应用。通过糖芯片识别能与特定糖探针特异性结合的酶，可用于快速鉴定酶的底物特异性及其催化活性[26,57,74,75]，包括糖基转移酶、糖苷酶、激酶和磺基转移酶。Park等[38]用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和岩藻糖制成糖芯片，加入β-1,4-半乳糖基转移酶(GalT)和UDP-半乳糖孵育，检测结果发现半乳糖被GalT选择性转移到GlcNAc片段形成N-乙酰乳糖胺(LacNAc)，显示了GalT的底物特异性。Sung等[57]制备了含有多个不同糖探针的糖芯片，采用类似的方法，根据对酶催化终产物的荧光标记测定，定量检测了不同酶的反应活性。

糖芯片也可以定量分析蛋白质和糖的结合作用[38,46,76,77]。早期研究中，Shin等[38]用糖芯片检测荧光标记的蛋白和可溶性样品的混合物，根据与芯片结合蛋白的荧光强度来确定抑制剂的IC50值，从而进行定量分析。之后又通过糖芯片测定不同糖探针与孵育蛋白结合的Kd值。

5.2 糖芯片在药物开发和临床诊断中的应用

许多病原体表面存在大量多糖结构或糖基复合物，其中的部分多糖结构被发现具有免疫原性。糖芯片可用于分析糖抗原-抗体相互作用以及特定的糖结合抗体与病原体的结合。Willats等[31]制备的多糖抗原芯片可以与相应单克隆抗体特异结合，而且该芯片检测限度(约80 fg)大大优于常规使用的酶联免疫法和免疫斑点法(约5 pg和10 ng)。Wang等[10]制备含有48种微生物多糖探针的芯片检测与人抗体的结合，仅需微量人血清(约1 μL)。

许多致病菌的菌毛上表达特定的凝集素，它们与宿主细胞表面多糖的结合与细菌的致病性相关[78,79]。有报道利用糖芯片检测不同样品，包括血液样品中细菌和病毒与糖的结合特性[5,80,81]。例如，Park等[82]制备了含有甘露糖探针的糖芯片可用于检测菌毛末端表达甘露糖结合蛋白FimH的大肠杆菌ORN178菌株。

病原体表面的凝集素与宿主细胞表面的糖进行特异性识别，破坏这种识别作用的抑制剂有可能预防或治疗相关疾病[12,14]；或者某些与疾病相关的糖生物合成过程需要酶的参与，通过糖芯片筛选针对这些酶的抑制剂有助于其应用于新药物的筛选和开发。Shin等[83]将多糖制成糖芯片，通过与细胞表面凝集素相互作用引发细胞反应来快速筛选功能性聚糖。他们将含有31种多糖的糖芯片与荧光探针PF1标记的表达SIGN-R1的哺乳动物细胞孵育，当多糖与细胞表面的SIGN-R1结合时会引发细胞应答产生单线态氧，使PF1发出荧光。根据荧光强度可以定量地检测细胞与多糖的结合。糖芯片检测与传统细胞分析中结果一致。以上结果表明，糖芯片可以高通量快速的筛选增强细胞表面凝集素相关细胞反应的聚糖。直接应用糖芯片分析细胞的文献报道还很少，也存在很多挑战，要更好的应用该方法，还需要对测试条件进一步优化[15]。因此，糖芯片技术未来将可在疾病诊疗技术的开发和新型药物的研究工作中发挥更大的作用。

6 展望

近年来，糖芯片已经成为研究糖生物学的强大变革性工具，已被逐渐用于快速分析与糖特异性结合的生物大分子、病原菌乃至细胞，也为糖类药物的开发提供了有价值的信息，但是目前仍然存在一些问题限制了糖芯片技术的广泛应用和进一步发展。首先，糖结构具有多样性，其与载体结合的方式可能影响糖芯片的结合效率从而限制糖芯片的应用。其次，糖芯片技术提供了许多生物信息，但是目前没有统一的体系和标准，不易于直接将结果应用于不同的研究中。因此随着糖科学的进一步发展，糖库所含结构的数量仍需增加，载体材料和糖分子在芯片上的排列方式也会进一步得到开发和优化，从而充分挖掘糖芯片技术的应用潜力，使糖芯片技术更加完善，并在未来的生物学和生物医药研究中得到更加广泛的应用，发挥更加重要的作用。