ADAM33基因S1、S2位点多态性与新疆维吾尔族COPD的相关性

王 菲，胡 昕，齐曼古力·吾守尔，孙 慧，王 晶

(新疆医科大学第一附属医院呼吸科，乌鲁木齐 830054)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种由有害颗粒导致的肺部异常炎症的呼吸道疾病，症状持续存在，其以不完全可逆且进行性发展的气流受限为特点[1]；到2020年，预计COPD将居升全球死亡原因第3位[2]，其防治工作刻不容缓。目前COPD的发病机制尚不全部明了，多项研究证实遗传因素与其发病机制相关。GOSMAN等[3]于2007年首次指出ADAM33基因的单核苷酸多态性(single nucleotide poly-morphisms,SNPs)通过影响气道的高反应性、炎症从而参与COPD病理、生理过程。由于地域、种族、研究对象选取等不同,ADAM 33基因的SNPs与COPD的相关性研究结果存在差异，目前仍在探索中。本研究旨在探讨ADAM33基因S1、S2位点的SNPs与新疆地区维吾尔族COPD患者易感性及肺功能下降的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年6月至 2013年6月就诊于本院呼吸内科，确诊为COPD的维吾尔族患者100例作为观察组，其中男 41例，女 59 例，年龄(58.73±15.19)岁；纳入标准：COPD患者诊断参照文献[4]，且患者入组前均未接受过药物正规治疗。排除标准：排除合并支气管哮喘、 支气管扩张、 间质性肺疾病、结核、肺癌、心血管疾病等病史的患者。选取同期140例维吾尔族健康体检者作为对照组，其中男54例，女86例；年龄(57.44±14.72)岁。两组对象年龄、性别、吸烟指数比较，差异均无统计学意义 (P>0.05)；两组对象第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)、FEV1占预计值百分比比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。资料采集及处理采用双盲原则进行；该研究经医院伦理委员会审核批准，受试对象均知情并签署知情同意书。

表1 两组对象临床相关资料比较

1.2方法

1.2.1DNA的提取及鉴定 采集研究对象空腹外周静脉血5 mL，使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，放置于-80 ℃保存。 采用非离心柱型血DNA提取试剂盒的提取DNA，同时采用超微量分光光度计检测提取的DNA纯度和浓度。

1.2.2聚合酶链反应(PCR) 引物序列来源NCBI数据库http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。引物由上海生工生物有限公司合成。S1位点上游引物：5′-CTG GGA GTC GGT AGC AAC AC-3′，下游引物：5′-CCT GTG CAG GCT GAA AGT ATG-3′;S2位点上游引物：5′-CTC GGA GCC TAC CCA CTG C-3′，下游引物：5′-CCG CAG ACC ATG ACA CCT TC-3′。反应体系为50 μL，包括DNA 1.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，Taq Buffer 5 μL、MgCl2(25 mmol/L) 5 μL、Taq酶5 μL，其余为双蒸水。 扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；55～65 ℃退火35 s；72 ℃延伸40 s；72 ℃修复延伸5 min；35个循环数。1%琼脂糖电泳20 min，电泳观察是否扩增成功。

1.2.3限制性片段长度多态性(RFLP)检测 对PCR扩增产物进行酶切,使用RFLP检测。 酶切体系为15 μL，包括PCR产物10 μL，限制性内切酶0.1 μL，10×Buffer 1.5 μL，余为双蒸水，恒温37 ℃，水浴过夜。酶切产物在TBE缓冲液中电泳30 min，条件为2%琼脂糖凝胶、100 V电压，凝胶图像系统对结果的进行分析，得出基因型。

1.2.4测序分析 将扩增片段使用生工SK1141试剂盒进行测序，测序结果采用BLAST软件与数据库录入的序列分析同源性，验证得到的扩增基因片段正确性。

1.2.5肺功能检测 两组对象均进行基础肺功能及支气管舒张试验肺功能的测定，肺功能检测仪器为德国Yeager生产，支气管扩张剂使用沙丁胺醇，检测用药前后的FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEV1/预计值%等指标。

2 结 果

2.1S1、S2位点基因型检测及测序结果 对所有研究对象进行基因型检测，ADAM33基因S1位点基因的扩增产物为192 bp DNA片段；S2位点基因的扩增产物为166 bp DNA片段。经2%琼脂糖凝胶电泳后，S1位点有3种基因型CC(166 bp)、TT(128、38 bp)、CT(166、128、38 bp)；S2位点也有3种基因型CC(166 bp)、GG(102、64 bp)、CG(166、102、64 bp)。验证PCR扩增基因片段的正确性测序结果，见图1。

图1 S1、S2位点部分测序结果

2.2遗传平衡符合性检验 对两组对象χ2检验验证S1、S2位点的基因型分布，其均符合 HarDY-Weinerg遗传平衡(χ2=0.29、0.62，P>0.05)，表明样本具有群体代表性。

表2 S1、S2位点基因型与等位基因频率分布比较[n(%)]

2.3两组对象S1、S2位点基因型和等位基因频率分布比较 S1位点的基因型和等位基因频率分布两组对象比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组对象S2位点的基因型及等位基因的频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4S1位点基因型的SNPs与COPD易感的相关性分析 Logistic回归分析显示，携带突变基因T的基因型(包括CT、TT)和野生基因型(CC)比较，前者能明显降低COPD发生的危险性(OR=0.12，95%CI：0.02～0.59)，见表3。

2.5两组对象基因位点的单体型和连锁不平衡 对基因S1、S2位点进行单倍体型匹配，得到4种单倍体型，其中单体型H1(CC型)、H3(CG)两组对象比较差异无统计学意义(P=0.55、0.22)；单倍体型H2(TC型)、H4(TG)中，观察组的基因型频率小于0.05，故不分析，见表4。S1、S2多态性位点间存在连锁不平衡(D′=0.47，r2=0.04)。

表3 S1位点不同基因型与发生COPD的相关性[n(%)]

表4 S1、S2位点单体型基因频率分析[n(%)]

2.6S1位点的SNPs与COPD患者肺功能相关指标的关系 S1位点携带突变基因T的基因型(CT、TT)和野生基因型(CC)患者的FEV1/FVC、FEV1/预计值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 观察组S1位点不同基因型与肺功能指标的关系

3 讨 论

GOSMAN等[3]于2007年首次指出ADAM33基因的SNPs与COPD相关，开启了该疾病新的研究方向。ADAM33基因表达具有一定的组织特异性，UMLAND等[6]发现其主要表达于成纤维细胞、平滑肌细胞和肌纤维细胞。DIJKSTRA等[7]在肺组织中的基底上皮细胞和血管内皮细胞检测到其表达，对于生长因子、炎症介质的释放也有参与，考虑ADAM33基因参与了气道重塑、炎症反应和血管的生成。

近年国内外对ADAM33的SNPs与COPD相关性的研究结果不一。目前研究转向至不同地域、不同民族等差异。LAXMI等[8]得出结论印度人群ADAM33的 S1、S2位点多态性在COPD病因遗传因素起重要作用。当然ADAM33基因的SNPs与COPD存在相关性受到很多学者质疑。目前对ADAM33基因S1、S2位点与COPD之间关系存在异议，PABAT等[9]发现在德国人中ADAM33基因S2位点SNPs对COPD发展过程无影响，与其不相关。有研究表明新疆地区维吾尔族人群COPD高发[10]，本研究选取该地区COPD患者进行分析，探讨其与ADAM33基因S1、S2位点SNPs的相关性，得出S1、S2位点基因型样本具有群体代表性，在新疆地区维吾尔族人群中COPD与ADAM33基因S1位点相关。考虑不同地区、不同种族COPD患者与ADAM33基因S1、S2位点SNPs的关系有所不同，值得进一步深究。

TAN等[11]发现位于中国内蒙古地区蒙古族ADAM33 的S2、S1位点SNPs与COPD易感性有关。AIERKEN等[12]对不同民族、地域的ADAM33基因SNPs研究结果进行Mata分析，结果提示亚洲人种中ADAM33基因中S1与发生COPD危险性有关，而在欧洲人种中不相关。S2 与任何人种发生COPD的危险都无关。ZHOU等[13]对5篇关于欧洲人种和8篇关于亚洲人种的13个研究进行分析，得出S1位点SNPs与亚洲人种、欧洲人种发生COPD危险性有关；ZHANG等[14]通过不同民族、地域分类进行Meta分析，得出S1位点SNPs是中国吸烟人群发生COPD的危险相关遗传因素之一。本研究得出ADAM33基因的S1位点SNPs与新疆地区维吾尔族人群COPD的危险性相关，并且推测S1位点突变基因T等位基因可能为该人群COPD发病的保护性遗传因素。本研究未得出S2位点SNPs与新疆地区维吾尔族人群发生COPD的相关性，故S2位点SNPs与COPD的关联性尚不确定。

本研究对ADAM33基因S1、S2位点进行单倍体型分析，其单倍体型与新疆地区维吾尔族人群COPD发生无关联。EL-ZAHER等[15]研究埃及人群COPD吸烟患者的ADAM33基因发现其S1与肺功能下降明显相关。根据本研究得出S1位点SNPs与新疆地区维吾尔族COPD患者肺功能中FEV1/FVC、FEV1/预计值不相关。首先考虑本研究样本量尚不够多，需扩大样本量进一步深入研究；其次不排除地域、种族的差异导致的差异性。