黄芪-葛根配伍对葛根素在2型糖尿病大鼠体内药动学的影响

袁丽君，涂 星,2△，佟智斌，谭 红，邱路雅，李 莹

(1.湖北民族学院医学院中医药系，湖北恩施 445000；2.风湿病发生与干预湖北省重点实验室，湖北恩施 445000)

黄芪-葛根为临床常用对药，起源于清代名医李用粹的《证治汇补》卷三，以黄芪一两、葛根五钱组成；后张锡纯在《西学衷中参西录》中的玉液汤选用黄芪五钱、葛根一钱半以治疗消渴症[1]；现代临床常用于治疗气阴两虚之高血压、糖尿病和卒中后遗症等[2]，尤其适用于糖尿病合并高血压、冠心病和脑血管病变的患者[3]。王春怡等[4]研究发现该药对通过降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高糖耐量、增加小鼠对胰岛素的敏感指数和降低胰岛素抵抗(IR)指数，同时下调血脂和血清中游离脂肪酸的水平，发挥治疗糖尿病及IR作用。现代研究还证实，黄芪-葛根配伍对肝脏糖脂代谢、胃黏膜损伤、糖尿病肾病(DN)、糖尿病心肌病、神经根型颈椎病等都具有较好的治疗或保护作用[5-9]。而黄芪-葛根以2∶1和3∶1的比例配伍是否对其主要有效成分葛根素的代谢存在影响，本研究拟通过对糖尿病大鼠体内葛根素的药代药动学研究，探讨其体内动力学特征，为黄芪-葛根临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SD大鼠40只，SPF级，体质量(200±20)g，雌雄各半，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2仪器 LC-2030C高效液相色谱仪(四元梯度高压输液系统、自动进样系统、二极管阵列检测系统等)购自日本岛津公司，BSA224S-CW十万分之一电子分析天平购自塞多利斯科学仪器北京有限公司，VX-200涡旋混合仪器购自美国Labnet公司，5810R高速低温冷冻离心机购自德国eppendorf公司，Milli-Q超纯水系统购自贝徕美生物科技有限公司，KQ2200E型超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司，BUCHI R-210旋转蒸发仪购自瑞士步琦公司，低温冰箱购自河南新飞电器集团有限公司。

1.1.3药物与试剂 葛根、黄芪中药饮片，购于恩施宏升大药房，经湖北民族学院医学院朱敏英教授鉴定分别来源于豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的根和豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的根；葛根素对照品(批号：110752-201615)，购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯；水为去离子超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.12型糖尿病(T2MD)大鼠模型的建立和分组 将SD大鼠40只适应性喂养1周后，随机分为对照组(10只)和造模组(30只)。造模组采用腹腔注射低剂量链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，用pH4.2柠檬酸钠缓冲液配制成0.25%(现配现用)，3 d后断尾取血，用血糖仪检测随机血糖水平。以大鼠血糖大于或等于16.7 mmol/L为成功模型大鼠。对照组大鼠腹腔等量注射pH为4.2柠檬酸钠缓冲液。结果造模成功大鼠26只，剔除血糖值过高(≥26.0 mmol/L)2只，将剩余24只大鼠随机分为葛根组(黄芪葛根0∶1)、黄芪葛根A组(黄芪-葛根2∶1)、黄芪葛根B组(黄芪葛根3∶1)，每组8只。

1.2.2给药、样品采集和处理 按照黄芪-葛根不同配比(3∶1、2∶1、0∶1)，固定葛根用量，称取药材，加10倍量水煎煮1.5 h，滤过，滤渣加8倍量水煎煮0.5 h，滤过，合并两次滤液，减压浓缩至含生药量1.0 g/mL。黄芪-葛根不同配比(3∶1、2∶1、0∶1)组禁食不禁水12 h后，分别灌胃给予相应的水煎液(给药量折合葛根素为200 mg/kg)；对照组(8只)同法给予黄芪-葛根0∶1水煎液，另2只大鼠麻醉后腹主动脉采集空白血15份于1.5 mL抗凝管中。于给药后0、2、5、10、15、20、30、45、60、120、180、240、300、360、420 min以肝素钠浸泡过的毛细管眼球后静脉丛采血0.3 mL于1.5 mL抗凝管中，于高速冷冻离心机中15 000 r/min离心15 min，分离血浆。精密移取分离的血浆100 μL于1.5 mL离心管中，加入400 μL乙腈-甲醇(1∶9，V/V)溶液，涡旋震荡3 min，于高速冷冻离心机15 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.2.3高效液相色谱法(HPLC)检测血浆中葛根素水平分析方法建立 (1)色谱条件：色谱柱为SinoChrom ODS-BP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸(35∶65)；流速1.0 mL/min；检测波长250 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。(2)适用性实验：在该色谱条件下，取对照品溶液(1 000 μg/mL)、供试品溶液和空白血浆，分别按照上述色谱条件进样，考察待测峰的保留时间、分离度和理论塔板数。

1.2.4标准曲线溶液配制 精密称取置于P2O5中干燥至恒质量的葛根素标准品10 mg，加30%甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 mg/mL对照品储备液，50、100、200、400、600、1 000、2 000、3 000 μL于10 mL容量瓶，加30%乙醇定容刻度，即得系列浓度的对照品溶液。

1.2.5精密度实验 取1.2.4项下5、20、100 μg/mL的葛根素对照品溶液，按1.2.3项色谱条件重复进样6次，测定峰面积计算稳定性相对标准偏差(RSD)。

1.2.6稳定性实验 分别取葛根组及黄芪葛根A、B组10 min时的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h后按1.2.3项下色谱条件分别进样3次，测定峰面积，以平均峰面积计算稳定性RSD。

1.2.7回收率实验 另取正常大鼠空白血9份分为3组，分别加入葛根素标准品1、2、4 mg，于高速冷冻离心机中15 000 r/min离心15 min，分离血浆，精密移取分离的血浆100 μL于1.5 mL离心管中，加入400 μL乙腈-甲醇(1∶9，V/V)溶液，涡旋震荡3 min，于高速冷冻离心机中15 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，按1.2.3项下进样，计算平均回收率。

1.2.8解冻-冻融稳定性实验 分别取葛根组及黄芪葛根A、B组10 min时的供试品溶液，置于-18 ℃冰箱中存放6 h，室温放置解冻，循环3次后，按1.2.3项下色谱条件分别进样3次，测定峰面积，以平均峰面积计算稳定性RSD。

1.2.9药物动力学(PK)模型的拟合 采用PKsovler软件绘制药-时曲线，对各组大鼠血浆中葛根素的血药浓度-时间关系进行PK房室模型拟合，以Akaikei′s信息量准则值(AIC)、残差平方和值(RSS)、拟合度决定系数(R2)指标筛选最佳房室模型(RSS越小，R2越大，AIC越小表明所建立的模型越佳)，输出PK相关参数。

2 结 果

2.1各组血浆中葛根素水平 在HPLC条件下，葛根素的保留时间约为3.95 min，分离度R>1.5，理论塔板数以葛根素计不少于4 000，表明血浆样本中葛根素分离度良好，空白血浆其他成分无明显干扰。各组血浆中葛根素水平，见图1。

A:葛根对照品溶液;B:空白血浆;C：葛根单煎液血浆样品供试液;D：黄芪-葛根配伍血浆样品供试液

2.2标准曲线的制备 将对照品溶液按1.2.3项下色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果求得回归方程为Y=66 448.986 7X-175 666.002 4，相关系数r=0.999 6，表明葛根素在5～300 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.33组供试品精密度实验结果 葛根组及黄芪葛根A、B组RSD分别为0.671%、0.293%、1.414%，表明仪器精密度良好。

2.43组供试品稳定性实验结果 葛根组及黄芪葛根A、B组RSD分别为2.612%、2.791%、2.592%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.53组供试品回收率实验结果 葛根组及黄芪葛根A、B组平均回收率分别为96.14%、97.22%、99.04%，RSD分别为2.65%、2.69%、2.45%，表明回收率良好。

2.63组供试品解冻-冻融稳定性实验结果 葛根组及黄芪葛根A、B组RSD分别为1.06%、1.10%、0.98%，表明反复冷冻、融化对样品无明显影响。

2.7PK模型的拟合 各组大鼠血浆中葛根素的血药浓度-时间关系经拟合，综合考虑RSS、R2和AIC，确定葛根素的最佳房室模型均为一室模型，结果见表1；其药-时曲线见图2，其PK参数见表2。对照组大鼠灌胃给予葛根水煎液后，葛根素在其体内的吸收较快，而在糖尿病大鼠体内的吸收会减缓(P<0.05)、消除时间和达峰时间(Tmax)延长(P<0.05)，0～420 min生物利用度(AUC0-420)、时间曲线下面积(AUMC)、平均滞留时间(MRT)均明显增加(P<0.05)，表观分布容积(V/F)和表观清除率(CL/F)无明显性差异。在糖尿病大鼠中，与黄芪葛根0∶1比较，黄芪-葛根以2∶1和3∶1比例配伍时，葛根素体内吸收速率加快(P<0.05)，而消除时间、V/F、CL/F、AUC0-420、AUMC、MRT均明显增加(P<0.05)，但Tmax和高峰浓度(Cmax)差异无统计学意义(P>0.05)，且黄芪-葛根以3∶1比例配伍时上述指标变化更明显(P<0.05)。

表1 各组大鼠葛根素的药动学隔室模型判断指标

表2 各组大鼠血浆中葛根素的房室模型PK参数

续表2 各组大鼠血浆中葛根素的房室模型PK参数

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与葛根组比较；c:P<0.05,与黄芪葛根A组比较

A:对照组(葛根-黄芪0∶1);B:葛根组;C:黄芪葛根A组;D:黄芪葛根B组

3 讨 论

糖尿病是由于胰岛素分泌缺乏和(或)胰岛素生物效应受损而引起的以慢性高血糖为主症，同时伴有脂肪、蛋白质、水和电解质紊乱的代谢性疾病，属于中医“消渴证”范畴。黄芪和葛根是治消渴古方中配伍的常用药味，其中黄芪“甘温益元气，甘温除大热，故通主之；气旺则津液生，故止渴”。而葛根“治脾胃虚而渴，除胃热，善解酒毒，通行足阳明经之药”，故常作为药对使用。

现代研究发现，黄芪-葛根药对在糖尿病上广泛使用，对其并发症诸如DN、糖尿病心肌病、糖尿病IR、糖尿病肝病等具有较好的治疗作用[10-12]，且对胃黏膜损伤具有一定的保护作用[6]。而葛根素为葛根干燥根茎提取的一类黄酮化合物，研究表明葛根素具有改善高血糖导致的心肌细胞损伤，维持心室肌细胞的功能，保护视网膜神经元以延缓糖尿病大鼠视网膜病变等作用[13-14]。

本研究发现，葛根素在健康大鼠和糖尿病大鼠体内的药动学行为存在明显差异。与健康大鼠比较，葛根素在糖尿病大鼠体内的吸收半衰期、消除半衰期和Tmax延长(P<0.05)，AUC0-420、AUMC、MRT明显增加(P<0.05)，表明葛根素在糖尿病大鼠体内的生物利用度增加，MRT更长，提示在糖尿病患者服用葛根素时应注意给药间隔，避免药物蓄积引起不良反应。

此外，本研究发现黄芪-葛根以0∶1、2∶1和3∶1比例配伍时，葛根素在糖尿病大鼠体内的药动学行为均存在明显差异。主要表现为黄芪-葛根配伍使用时相对于单用葛根吸收半衰期和Tmax明显缩短(P<0.05)，CL/F明显降低(P<0.05)，而消除半衰期、V/F、AUC0-420、AUMC、MRT均明显增加(P<0.05)，吸收半衰期和Tmax的缩短提示二者配伍后可有效加快葛根素的吸收，快速发挥治疗作用；而AUC0-420、AUMC的增加提示二者配伍后增加了葛根素的生物利用度，可能提高了治疗糖尿病效果；MRT和消除半衰期的延长提示二者配伍后葛根素在体内的代谢时间延长，有助于延长药效作用时间。该结果提示黄芪与葛根配伍增效的作用机制可能与黄芪改变葛根药动学参数有关。

本研究中发现，黄芪-葛根以2∶1、3∶1比例与0∶1比例配伍时比较，葛根素吸收Cmax、半衰期、Tmax、CL/F、消除半衰期等均有明显变化，提示黄芪可以延长葛根素在大鼠体内吸收半衰期，从而增加葛根素的治疗时间。黄芪-葛根以0∶1、2∶1和3∶1比例配伍时Cmax及Tmax均无明显差异，表明葛根素在体内吸收可能具有饱和现象，提示其在体内的吸收可能除了被动吸收外，还存在主动转运和易化扩散等多种方式。黄芪-葛根以3∶1比例配伍时消除半衰期、V/F、AUC0-420、AUMC、MRT等参数的变化较黄芪-葛根2∶1配伍时变化更明显(P<0.05)，证实了黄芪-葛根的配伍比例可影响葛根素在体内的药动学行为。

综上所述，本研究从药动学行为上验证了黄芪-葛根以2∶1和3∶1的比例配伍时与单用葛根时体内药动学行为存在明显差异，二者配伍时黄芪可有效提高葛根素在大鼠体内的生物利用度，减缓消除时间，延长药物作用时间而达到协同增效的目的。