高危型人乳头瘤病毒 E6/E7 mRNA和DNA检测对2级以上宫颈上皮内瘤变诊断价值的Meta分析

吴 双，朱月华

(徐州医科大学附属淮海医院妇产科，江苏徐州 221000)

宫颈癌是严重危害女性健康的最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，其发病率高居女性恶性肿瘤的第三位[1]。该病在发展中国家女性中的发病率及病死率均高于发达国家[2]。我国作为最大的发展中国家，每年约有13万宫颈癌新发病例，占全世界新发病例总数的1/4左右[3]。大量研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染，特别是高危型HPV持续感染是引起宫颈癌病变的主要原因和必要条件[4]。因此，进行HPV检测已成为早期筛查和预防控制宫颈癌的重要手段之一。HPV的E6/E7 mRNA检测法和DNA检测法是目前检测HPV的两种最主要的方法。有很多研究对这两种检测方法的诊断价值进行了对比分析，但各研究间的结果仍存在一定差异性。本研究是在前期研究的基础上，通过系统评价的方式对比这两种检测方法在我国高级别宫颈癌[2级以上宫颈上皮内瘤变(CIN2+)]中的诊断价值，以期为我国临床工作提供可能的循证医学方面的参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入标准：(1)国内外公开发表的比较HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA诊断CIN2+的研究，截止至2017年10月31日；(2)以病理学诊断作为明确诊断的金标准；(3)诊断四格表数据可以直接提取或间接获得；(4)研究对象为我国患者。排除标准：(1)数据库间重复的文章；(2)数据不全的研究；(3)数据重复的研究；(4)非中英文发表的研究。

1.2方法

1.2.1检索策略 采用主题词和自由词相结合的方式通过计算机检索以下数据库：PubMed、Cochrane Library、中国生物医学文献数据库、CNKI、万方等。英文检索词：cervical precancerosis，cervical cancer，cervical disease，cervical lesion，CIN，cervical intraepithelial neoplasia，cervical carcinoma，human papilloma virus，HPV，DNA，mRNA，E6/E7。中文检索词：宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、宫颈病变、CIN、人乳头瘤病毒、HPV、DNA、mRNA、E6/E7。此外，两名研究者还分别对纳入研究的参考文献进行了手工筛查。

1.2.2文献筛查及数据提取 文献检索筛查过程由两名研究者基于PRISMA(preferred reporting items for systematic reviews and meta-analyses)的流程独立完成。数据的提取也由两名研究者独立进行并各自获取相应的一份数据，而后将两份数据信息进行对比，若两者间存在分歧，则通过共同讨论的形式以达成一致。提取的主要资料信息：第一作者，发表年份，样本量，mRNA检测方法，DNA检测方法，患者的病理分级，真阳性、假阳性、假阴性和真阴性。

1.2.3质量评价 由两名研究者采用QUADAS方法独立地对纳入研究进行质量评估[5]。该评价方法共包含14项条目，每项条目均分为“是”“否”和“不清楚”。“是”为符合，“否”为不符合，“不清楚”为部分符合或无法获得足够的信息进行评价。若纳入研究符合全部14项条目，则评定为“A”；若有一项以上为“不清楚”，则评定为“B”；若出现一项以上为 “否”时，则评定为“C”。

1.3统计学处理 采用Meta-disc 1.4软件进行统计学分析。首先进行异质性检验：采用I2值评价各研究间的异质性，I2≥50%时采用随机效应模型，I2<50%则采用固定效应模型。其次，采用Spearman相关系数检验是否存在阈值效应，P≥0.05表示不存在阈值效应，异质性由其他来源产生。计算HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA诊断CIN2+的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和诊断比值比的数值及其95%CI，绘制综合受试者工作特征(SROC)曲线，计算曲线下面积(AUC)及Q*指数。根据mRNA检测方法的不同、DNA检测方法不同和样本量的大小进行亚组分析，并探究可能的异质性来源。

2 结 果

2.1纳入研究的一般特征 通过计算机检索各数据库，截止至2017年10月31日，共检索到文献1 774篇。按照PRISMA的文献筛选流程：(1)排除各数据库间相互重复的文献239篇；(2)通过读取文献的标题和摘要，排除文献1 403篇；(3)通过全文阅览排除文献111篇(非比较HPV E6/E7 mRNA和HPC DNA诊断CIN2+的文献84篇、无法获取四格表数据的文献26篇、数据重复的文献1篇)；最终符合纳入排除标准的文献共21篇[6-26]。21篇研究发表在2010-2017年，以英文发表4篇，以中文发表的17篇。样本量为43～2 000例，样本量≥100例的研究13篇[6,8,-11,13-16,18,21,23-25]，样本量小于100例的研究8篇[7,9,12,17,19-20,22,26]。以Kodia法进行HPV E6/E7 mRNA检测的研究12篇[7,11-13,15-16,19-22,24,25]。以Aptima法进行HPV E6/E7 mRNA检测的研究4篇[8,10,18,23]。以Diacarta法进行HPV E6/E7 mRNA检测的研究2篇[6,9]。不清楚HPV E6/E7 mRNA检测的研究3篇[14,17,26]。以杂交捕获法进行HPV DNA检测的研究4篇[6,8-9,21]。以PCR+膜杂交法进行HPV DNA检测的研究4篇[11,19-20,24]。以PCR+反向点杂交法进行HPV DNA检测的研究5篇[13,15,18,23,25]。以实时荧光定量PCR法进行HPV DNA检测的研究1篇[10]。不清楚HPV DNA检测的研究7篇[7,12,14,16-17,22,26]。各项研究的详细信息见表1。质量评定为A级的研究2篇[8,25]，质量评定为B级的研究19篇[6-7,9-24,26]。质量评定详细信息见表2。

表1 纳入的21项研究的一般特征

续表1 纳入的21项研究的一般特征

注：CIN为宫颈上皮内瘤变；ICC为宫颈癌

表2 QUADAS条目及纳入文献的质量评价(n)

表3 HPV E6/E7 mRNA和DNA诊断CIN2+的比较

2.2统计学分析结果

2.2.1异质性分析 采用Meta-Disc 1.4软件进行分析， HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA诊断CIN2+的统计学分析存在一定异质性，故分析采用的是随机效应模型。为了探讨异质性的来源，首先进行了Spearman相关系数的检验，结果未发现阈值效应的存在，提示异质性可能由非阈值效应产生。我们还根据mRNA检测方法的不同、DNA检测方法的不同和标本量的大小进行了亚组分析，也未发现异质性的主要来源。

图1 HPV E6/E7 mRNA诊断CIN2+的灵敏度

图2 HPV DNA诊断CIN2+的灵敏度

图3 HPV E6/E7 mRNA诊断CIN2+的特异度

2.2.2效应量的分析 HPV E6/E7 mRNA和DNA诊断CIN2+的灵敏度为0.87(图1)和0.87(图2)、特异性为0.73(图3)和0.6(图4)、阳性似然比为2.52和1.54、阴性似然比为0.25和0.34、诊断比值比为10.28和4.73、SROC曲线的AUC为0.849 7(图5)和0.704 8(图6)、Q*指数为0.780 9和0.656 8。此外，根据检测方法的不同和样本量的大小对主要的亚组进行了分析，并列出了亚组分析的数据，见表3。

图4 HPV DNA诊断CIN2+的特异度

图5 HPV E6/E7 mRNA诊断CIN2+的SROC曲线

图6 HPV DNA诊断CIN2+的SROC曲线

3 讨 论

宫颈癌的发病率高居中国女性生殖道恶性肿瘤的第一位。HPV持续感染是宫颈癌发生、发展的主要原因和必要条件，因此检测HPV的感染有助于宫颈癌的早期诊断和治疗[4]。研究表明，99%以上宫颈癌患者均具有HPV感染[3]。我国女性HPV的感染率为16.8%，有70%～80%的女性一生中至少感染过1次HPV。绝大多数女性患者的HPV感染是暂时性的，可以通过自身免疫机制的作用自行清除，感染平均持续时间为8～12个月，仅有少数患者无法通过自身免疫机制清除感染的HPV，在持续感染的情况下逐渐发展成CIN甚至宫颈癌[27]。

HPV DNA检测是目前一种广泛应用与临床的用于宫颈癌筛查和随访的诊断方法，可以很好地监控病毒的基因组拷贝和分型。但只有很少一部分HPV感染的患者会发展成宫颈癌，HPV DNA检测作为一种病因学诊断方法，无法对HPV感染阶段及病毒癌基因的活性进行判断，具有特异度较低的缺点，导致假阳性率较高，可能增加患者的心理负担，甚至出现过度治疗[28]。HPV引起致癌作用的基因主要为E2、E6和E7，病毒DNA一旦整合于宿主细胞基因组中，使编码特异性DNA束缚蛋白的E2区缺失或灭活，从而引起E6和E7两种癌基因的转录，进而使编码的2种癌蛋白——E6和E7过表达[29]。E6和E7蛋白通过抑制抑癌基因活性、激活端粒酶等机制，最终导致细胞周期失控，使正常宿主细胞向恶性化方向转化[30]。很多研究表明，HPV E6/E7 mRNA的表达与宫颈病变严重程度呈正相关[31]。目前HPV E6/E7 mRNA已较为广泛地应用于临床，且取得了较好的效果。此外，值得注意的是，液基细胞学检测的剩余标本可以直接进行HPV E6/E7 mRNA检测，不需要纯化和扩增，简化了步骤并降低了检测过程中的污染概率[13]。

有不少研究对HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA两种诊断方法的诊断价值进行了对比分析，但各研究间的结果仍存在一定差异性。本研究对这两种检测方法诊断CIN2+的诊断价值进行了系统评价，共纳入21项研究，结果显示：HPV E6/E7 mRNA和DNA两种方法诊断的灵敏度相当，均为0.87，存在一定的漏诊率(13%)；HPV E6/E7 mRNA法的特异度要高于DNA法(0.73vs. 0.60)，降低了CIN2+的误诊率，消除了部分患者的心理负担及过度治疗的情况；HPV E6/E7 mRNA法的阳性似然比(2.52vs. 1.54)、阴性似然比(0.25vs. 0.34)和诊断比值比(10.28vs. 4.73)均优于DNA法，表明HPV E6/E7 mRNA法对CIN2+的判别效果更好。SROC曲线的AUC和Q*指数反映诊断试验的准确性，可以看出HPV E6/E7 mRNA法在准确性方面也优于DNA法(0.849 7vs. 0.704 8；0.780 9vs. 0.656 8)，具有更高的诊断效能。笔者还根据这两种检测方法的不同和研究样本量的大小对主要的亚组进行了分析，以我国使用较多的Kodia法进行分组、以经过我国SFDA和美国FDA认证的杂交捕获法进行分组和以样本量大于100例的进行分组，结果均显示HPV E6/E7 mRNA法的诊断价值均优于DNA法。综合以上结果，相比HPV DNA法，E6/E7 mRNA法可能是一种更优的诊断CIN2+的方法。

但是本研究的结果存在一定的异质性，这在一定程度上限制了本研究结论的可靠性。经Spearman相关系数的检验，未发现阈值效应的存在，异质性可能来源于非阈值效应。虽然我们进行了亚组分析，但是仍然未发现异质性的主要来源。异质性的来源可能由以下原因造成：(1)地区不同、城市农村患者比例不同导致研究对象的存在差异性；(2)仪器设备及操作者水平不同导致检测过程存在差异；(3)不同研究者的设计方案和研究方法存在差异。除了研究间的异质性，本研究还存在部分研究的样本量偏少和整体质量不高的局限性。

综上所述，相比HPV DNA检测，E6/E7 mRNA检测可能具有更优的诊断CIN2+的价值。对于本研究存在的局限性，需要更多高质量的研究加以完善。