IL-6在子宫内膜异位患者血清中的表达及其潜在作用机制研究①

赵冬梅 耿旭景 谭 丽 张 丹 项云改 宋玉霞

(郑州大学第二附属医院生殖医学研究部，郑州450014)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMS)是一种常见的妇科疾病，通常表现为子宫腔外存在子宫内膜细胞，子宫内膜异位症大大增加了医疗费用，就美国而言每年高达220亿美元[1]。子宫内膜异位症的症状差别很大，包括痛经、性交痛、非循环性慢性盆腔疼痛以及不孕症，严重影响了患者的生活质量[2]。子宫内膜异位症大约影响5%的生育年龄妇女健康，常常伴随着不孕和盆腔疼痛，其中高达50%的患者是不孕的[3]。手术切除异位病灶和/或激素抑制来减少雌激素的产生，是目前治疗的金标准，然而上述方法常伴随着各种副作用及高复发率[4]，因此，确定子宫内膜异位症发病机制和寻找新的治疗策略至关重要。

研究发现，子宫内膜异位症与机体免疫炎症反应有关，多种免疫因子、细胞因子、炎症因子在子宫内膜异位症患者中异常表达[5,6]。IL-6由巨噬细胞和上皮细胞分泌，参与机体免疫反应、肿瘤进展、组织修复等过程[7]。最近研究发现，子宫内膜异位患者腹腔液和血清中IL-6表达均明显升高，且随着子宫内膜异位症分期增加，患者腹腔液、血清IL-6水平呈明显上升趋势；提示IL-6 可能参与子宫内膜异位的发生发展过程。此外，IL-6可促进淋巴细胞增殖活化，引发机体自身免疫炎症反应导致免疫损伤；IL-6还可促进子宫内膜上皮细胞增殖，最终导致子宫内膜异位发生[7]。然而，IL-6在子宫内膜异位中促进上皮细胞增殖、上皮间质转化的潜在机制仍未完全阐明。

本研究检测了IL-6在子宫内膜异位患者血清中表达及其对原代培养子宫内膜异位症患者上皮细胞增殖及上皮间质转化的影响，同时检测了其可能作用通路蛋白表达变化，并用免疫组化在病理样本中进行验证，进一步揭示了IL-6促进子宫内膜异位发生进展的潜在机制，为临床诊断治疗提供了新思路。

1 资料与方法

1.1资料 收集2014年6月～2017年1月间，郑州大学第二附属医院腹腔镜手术切除的卵巢子宫内膜异位囊肿(又称卵巢巧克力囊肿)临床样本共111例，上述子宫内膜异位标本均经过至少2位病理科医生诊断，且无其他重大内科疾病及接受激素治疗，另选取64例生殖中心对不孕患者原发不孕或内膜回声不均患者行内膜搔刮术获取的内膜组织作为对照。患者年龄在18～45岁间，且本研究已获得所有患者知情同意及郑州大学第二附属医院医学伦理委员会同意，所有实验操作均按照相关的指导方针和规定进行。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将获取的手术切除子宫内膜组织迅速运至无菌操作台中，用无菌Hank′s缓冲液(HBSS)(Hyclone，美国)洗涤3次，无菌剪刀剪碎并用0.03%的胶原酶Ⅳ(Sigma，美国)于细胞培养箱中消化40 min。取出用无菌筛网(Thermo Fisher Scientific，美国)过滤悬液，将未被消化完全的组织块分离出来，将细胞悬液进行离心，重悬进行选择性接触来纯化子宫内膜上皮细胞。将纯化的细胞用含10%胎牛血清(Gibco，美国)、1%青链霉素(Gibco，美国)和2 μg/ml氟康唑(BD，美国)的DMEM/F12培养液(Gibco，美国)重悬，并置于37℃、5% CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)中培养，待细胞达到80%～90%融合度时进行后续实验。

1.2.2细胞因子IL-6检测 收集患者空腹静脉5 ml，3 000 r/min离心10 min取上清，并置于-80℃保存待测。利用双抗体夹心ELISA法(R&D systems，美国)按照试剂盒操作步骤进行检测，将得到的数据根据标准曲线回归计算IL-6血清浓度。

1.2.3细胞增殖检测 使用MTT法检测细胞增殖能力，取5×103个细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h将20 μl的5 mg/ml的MTT(Sigma，美国)溶液加到各孔中，将细胞继续于细胞培养箱中孵育4 h，取出弃上清，每孔加入150 μl的DMSO(生工生物，上海)并在全波长酶标仪上振荡10 min，检测490 nm处各孔吸光度值，参考波长为570 nm。

1.2.4细胞侵袭迁移实验 使用Transwell 小室(BD，美国)检测细胞侵袭迁移能力变化，预铺基质胶的Transwell小室用于检测细胞侵袭能力变化，使用前用无菌PBS或无血清培养基水化30 min，而无基质胶的Transwell小室用于检测细胞迁移能力变化。取5×104个细胞用无血清培养基中重悬并接种至Transwell的上室中，下室加含10%胎牛血清完全培养基，在细胞培养箱中孵育48 h后，棉球擦去上室未穿膜细胞，用结晶紫(Solarbio，美国)染穿过膜的细胞，显微镜下观察并计数。

1.2.5Western blot检测 用添加蛋白酶抑制剂(Roche，美国)和磷酸酶抑制剂(Sigma，美国)的RIPA裂解液(全式金，北京)裂解细胞，4℃、12 000 r/min离心10 min取上清，BCA法(全式金，北京)测蛋白浓度。用SDS-PAGE电泳分离总蛋白(20 μg)并转移到聚偏二氯乙烯膜(Millipore，德国)上，用0.5%的脱脂牛奶封闭膜，并用p-STAT3、STAT3、BCL6和β-actin(CST，美国)一抗孵育，用过ECL发光液(Millipore，德国)进行显影，并用Image J软件测定条带强度，β-actin做内参进行标准化。

1.2.6免疫组化 按照先前文献所述进行免疫组织化学分析[8]。用含10%血清的PBS封闭子宫内膜组织石蜡切片，并用抗BCL6(CST，美国)进行孵育，然后将切片与偶联辣根过氧化物酶的二抗(福州迈新)一起温育，用DAB试剂盒(福州迈新)检测免疫反应性并用苏木精复染，显微镜观察并用半定量分级系统(H-score)比较免疫组化染色强度。

2 结果

2.1IL-6在子宫内膜异位患者血清中的表达 子宫内膜异位症是一种慢性炎症疾病，为了更好地了解子宫内膜异位症患者的炎症状态，我们使用ELISA测量了患有和不患有子宫内膜异位症的妇女血清中IL-6炎性细胞因子表达，研究结果显示，与不患有子宫内膜异位症的对照组相比，子宫内膜异位症患者血清IL-6水平明显升高(0.97±1.07、2.29±1.47，t=6.285,P<0.01)(图1)。

2.2IL-6 对子宫内膜上皮细胞增殖影响 通过原代培养的子宫内膜异位症腺上皮细胞成团生长，呈上皮样。用不同浓度的IL-6(0、5、10、20、40 ng/ml)处理细胞，MTT检测其对细胞增殖的影响，结果发现，与IL-6(0 ng/ml)组相比，IL-6 可呈浓度依赖性地促进细胞增殖(0.24±0.02、0.36±0.01、0.53±0.04、0.70±0.04、0.72±0.04，F=124.528，P=0.000)，而20 ng/ml组与40 ng/ml组之间差异无统计学意义(P>0.05，图2)，故后续研究选择 20 ng/ml 浓度IL-6进行实验研究。

2.3IL-6诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化子宫内膜异位症通常在卵巢和腹膜上发现子宫外腺体和间质的存在，上皮间质转化在这一过程中扮演者重要角色，利用Western blot检测上皮间质标记物，发现与0 ng/ml组相比，20 ng/ml的IL-6处理细胞后，其上皮标记物E-cadherin表达明显降低(t1=7.405，P1<0.01)，间质标记物vimentin和Snail表达显著增加(t2=9.032，P2<0.01；t3=9.279，P3<0.01)(图3、表1)。

图1 IL-6在子宫内膜异位患者血清中的表达Fig.1 Expression of IL-6 in serum of patients with endometriosisNote: *.P<0.01 compared with Control group.

图2 IL-6对子宫内膜上皮细胞增殖的影响Fig.2 Effect of IL-6 on proliferation of endometrial epithelial cellsNote: *.P<0.05 compared with IL-6 (0 ng/ml) group；#.P<0.05 compared with IL-6 (5 ng/ml) group.Compared with the IL-6 (10 ng/ml) group,△.P<0.05.

由此可知，IL-6可诱导子宫内膜上皮细胞发生上皮间质转化。

2.4IL-6 对子宫内膜上皮细胞侵袭迁移的影响 IL-6可诱导子宫内膜上皮细胞发生上皮间质转化，故利用Transwell实验检测其对细胞侵袭迁移能力的影响，实验发现与0 ng/ml组相比，20 ng/ml的IL-6处理后，细胞侵袭能力和迁移能力均显著降低(99.6±13.7、154.3±18.6，t1=4.101，P1<0.05；102.4±12.3、196.5±18.2，t2=7.420，P2<0.01)(图4)。由此可知，IL-6可增强子宫内膜上皮细胞侵袭迁移能力。

2.5IL-6 对子宫内膜上皮细胞STAT3/BCL6通路影响 有研究发现，BCL6可被IL-6等炎症因子及STAT3刺激上调[9]，故利用Western blot检测IL-6处理子宫内膜上皮细胞后BCL6、 STAT3、 p-STAT3蛋白表达。

图3 IL-6处理后上皮间质标记物的表达Fig.3 Expression of epithelial mesenchymal markers after IL-6 treatment

GroupsProtein levelsE-cadherinvimentinSnail0 ng/ml0.953±0.0810.324±0.0210.168±0.00920 ng/ml0.532±0.0561)1.021±0.1321)0.456±0.0531)

Note:1)P<0.01 vs 0 ng/ml group.

图4 IL-6对细胞侵袭迁移能力影响Fig.4 Effect of IL-6 on cell invasion and migrationNote: *.P<0.05 compared to 0 ng/ml group.

图5 IL-6处理细胞后STAT3/BCL6通路蛋白表达Fig.5 Expression of STAT3/BCL6 pathway proteins after IL-6 treatment

Western blot检测发现，与0 ng/ml组相比，20 ng/ml和40 ng/ml的IL-6处理细胞后，细胞中p-STAT3、BCL6表达均显著增加，STAT3表达无明显变化；与20 ng/ml组相比，40 ng/ml的IL-6处理细胞后细胞中p-STAT3、BCL6、STAT3表达无统计学差异(图5，表2)。由此可知，IL-6可诱导细胞中STAT3通路激活上调BCL6表达。

2.6BCL6在子宫内膜异位组织中的表达 为进一步验证IL-6可诱导子宫内膜上皮细胞中STAT3/BCL6通路激活，我们利用免疫组化法检测了BCL6在子宫内膜异位组织中的表达，结果发现，与Control组相比，子宫内膜异位组织中BCL6显著高表达(32.12±22.25、167.27±90.04，t=15.352，P<0.01)。由此推测，在子宫内膜异位患者中IL-6高表达可能通过诱导BCL6表达促进疾病进展，见图6。

3 讨论

子宫内膜异位症主要指子宫内膜腺体及间质组织异位至子宫内膜外引发的育龄期妇女常见妇科疾病，通常以异位至宫骶韧带、卵巢部位为主[10,11]。临床症状常常表现为盆腔疼痛、黏连、不孕，异位组织细胞与恶性癌细胞一样，具有恶性增殖、侵袭转移特性[12]。

GroupsRelative levels of proteinp-STAT3STAT3BCL60 ng/ml group0.301±0.0211.356±0.1210.065±0.0085 ng/ml group0.306±0.0241.321±0.1320.264±0.02110 ng/ml group0.291±0.0191.345±0.1060.879±0.09420 ng/ml group1.231±0.1351)1.301±0.1161.297±0.1351)40 ng/ml group1.138±0.1071)1.312±0.1241.246±0.1181)F114.0830.109114.542P0.0000.9770.000

Note:1)P<0.01 compared to the 0 ng/ml group.

图6 BCL6在子宫内膜异位患者组织中的表达Fig.6 Expression of BCL6 in endometriotic tissueNote: *.P<0.01 compared with Control group.

迄今为止，对于子宫内膜异位症发生进展机制尚未明确，异位种植学说是目前公认的理论机制，而近年来大量临床研究表明，多种免疫炎症反应有关的细胞因子、炎症因子参与了子宫内膜异位病灶形成，但其中潜在作用机制仍未阐明[13,14]。

IL-6是一种由单核巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞、滋养层细胞等分泌的细胞因子，参与机体的免疫炎症反应和组织修复过程，研究表明其高表达与盆腔局部黏连及输卵管损伤有关[15,16]。此外，IL-6还参与炎症瘢痕形成，刺激输卵管成纤维细胞增生进而导致输卵管阻塞引起不孕症发生[13]。许多研究表明，与无子宫内膜异位症相比，子宫内膜异位患者血清中IL-6明显增高，但其作用机制仍不清楚。有研究认为IL-6可刺激P450芳香酶表达，导致异位内膜发生种植，其在卵泡中的表达也会相应增高，引起卵泡发育不良，从而导致不孕症[13,17]。在本研究中发现子宫内膜异位患者血清中IL-6表达显著增加，且利用不同浓度IL-6处理原代子宫内膜异位上皮细胞可呈浓度依赖促进细胞增殖，其中20 ng/ml 最明显，同时也可诱导细胞发生上皮间质转化，促进细胞侵袭迁移。

BCL6是转录抑制因子，是B细胞发育和肿瘤发生所必需的[18]。BCL6由6个Krüppel型锌结构域和一个能够结合包括干扰素调节因子(IRF)4和BCL6相关锌指蛋白(BAZF)在内的BTB/POZ结构域组成；BCL6是人类原癌基因之一，且可通过抑制诸如p53和p30019基因表达来促进细胞增殖；BCL6的DNA结合位点[TTCCT(A/C)GAA]与信号转导和转录激活因子(STAT)类似，BCL6可通过STAT因子结合位点抑制转录，进而抑制细胞因子诱导的转录[3]。此外，BCL6可被STAT3诱导上调[19]。与无子宫内膜异位患者相比，子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜中STAT3信号异常激活[8]。最近有研究报道，BCL6在子宫内膜异位症患者的月经周期分泌期异位组织中高表达[20]。故我们猜想IL-6可能通过激活STAT3/BCL6通路发挥功能。通过Western blot检测发现，随着IL-6浓度增加，细胞中p-STAT3、BCL6表达逐渐升高，同时我们利用免疫组化发现BCL6在子宫内膜异位症标本中高表达，提示IL-6可激活STAT3/BCL6信号转导在子宫内膜异位中发挥作用。

综上所述，本研究证实了IL-6、BCL6在子宫内膜异位患者血清和组织标本中高表达，且随着IL-6浓度增加可呈剂量依赖地促进子宫内膜异位上皮细胞中STAT3/BCL6通路激活，进而促进细胞增殖及上皮间质转化过程，进一步揭示了IL-6促进子宫内膜异位发生进展的潜在机制，为临床诊断治疗提供了新思路。