RTKN2、LDLR、APOB和APOC1基因多态性与类风湿性关节炎的相关性①

闫 雯 张小珍 齐晓明 王 姣 尤崇革

(兰州大学第二医院检验医学中心，兰州730000)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种累及外周关节、滑膜以及结缔组织结构异常增生的慢性多系统性自身免疫障碍性疾病[1]，全球发病率可达1%，临床表现为滑膜炎症、关节损害和残疾。其发病机制复杂，受环境、感染因素[2]和遗传因素[3,4]多重影响，其中遗传因素可达50%[5]。文献报道日本人RTKN2基因rs3125734 C>T[6]、韩国人LDLR基因rs688 C>T、APOB基因rs693 C>T和APOC1基因rs4420638 A>G四个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)位点与RA易感相关[7]，但在中国人群尚无相关报道，需进一步验证。由于国外研究多采用高通量或Sanger测序等方法，技术要求高[8]、成本昂贵[9]，不适合临床常规化检测。为此，本文采用高效、简便、低成本的高分辨熔解曲线(High resolution melting，HRM)基因分型技术[10]，基于本实验室的聚合酶链式反应-高分辨率熔解(Polymerase chain reaction-high resolution melting,PCR-HRM)检测技术平台，建立这四个SNP的常规化PCR-HRM分子诊断方法，研究其与中国兰州地区汉族人群RA易感的相关性。

1 材料与方法

1.1研究对象 病例组588例为2011年7月至2014年5月经兰州大学第二医院风湿科确诊的RA患者，男性133例，女性455例，年龄(47.6±14.9)岁；对照组200例为同期体检健康者，男性72例，女性128例，年龄(49.6±15.4)岁。RA诊断采用2009年美国风湿病学会诊断标准[11]，排除合并其他慢性病，自身免疫性疾病及过敏史的患者。所有研究对象均为兰州地区没有血缘关系的汉族人，且已知情同意。本研究经兰州大学第二医院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 采集研究对象空腹EDTA-K2抗凝血2 ml，严格按照Quick Gene全血基因组DNA提取试剂盒(日本Fujifilm公司)说明书提取基因组DNA。通过Nano-drop2000微量蛋白核酸检测仪(美国Thermal Scientific公司)检测DNA浓度和纯度(A260/280nm>1.75，A260/230nm>2.0)，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA完整性后调整浓度至40 ng/μl，-40℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成 使用Primer 3(http://www.simgene.com/Primer3)和Beacon designer 7.0软件设计rs3125734、rs688、rs693和rs4420638的特异性引物，引物的特异性、有效性、Tm值(℃)和可辨性通过在线软件Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/Primer-blast/)、Two-state melting(httP://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-folding)、OligoAnalyzer3.1(http:wwwJPidtdna.com/calc/analyzer)和uMelt(http://dna.utah.edu/umelt.com/)验证。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物详细信息见表1。

表1各位点引物序列及产物长度

Tab.1Sequenceandampliconsizeofprimersetsofloci

SNPsGeneSequence of primer sets(5′→3′)Amplicon size(bp)rs3125734RTKN2P1 TGGCTCACTTGCAGGATACA118P2 TGGGCAGTTCCTTATTGGTCArs688LDLRP1 GGCCGCCTCTACTGGGTTGAC107P2 GGGTGGGCCAGCCTCTTTTCArs693APOBP1 AAGCCTACAGGACACCAAAATAAC125P2 ACATTCGGTCTCGTGTATCTTCTArs4420638APOC1P1 GCAATGTCACTATGC TACACTTTTCC112P2 ATCCTGGGGGAGAGAGTGAG

1.2.3PCR-HRM检测 PCR反应体系12 μl，包括10×buffer 1.2 μl、10 mmol/L dNTP 0.24 μl、5 mmol/L SYTO 13荧光染料(美国Life Technologies公司)0.06 μl、5 U/μl Platinum Taq DNA聚合酶(上海英骏技术有限公司)0.06 μl、50 mmol/L Mg2+0.36 μl、基因组DNA 1 μl、20 mmol/L正、反向引物各0.12 μl和DEPC水8.84 μl。PCR-HRM检测使用Rotor-Gene Q PCR仪(德国QIAGEN公司)。PCR扩增条件采用96℃预变性3 min；循环内rs3125734：96℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；rs688：85℃ 5 s，60℃ 5 s，70℃ 5 s，40个循环；rs693：90℃ 5 s，60℃ 5 s，70℃ 5 s，40个循环；rs4420638： 90℃ 5 s，62℃ 18 s，38个循环；终延伸72℃ 1 min。HRM检测条件为96℃变性10 s，50℃退火30 s，以0.15℃/step的分辨率收集71℃至89℃的熔解曲线数据[12]。根据熔解曲线峰型和Tm值进行基因分型后，随机挑选各位点不同基因型样本各3例进行普通PCR扩增，经4%琼脂糖凝胶电泳确定为单一明亮条带后，将产物送上海生工生物技术有限公司进行测序验证。

1.2.4血清学指标检测 采集RA患者空腹静脉血，分离血清，分别使用乳胶凝集法和ELISA法检测抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)和类风湿因子(Rheumatoid factor,RF)，结果以-/+表示。

1.3统计学分析 使用在线软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)进行四个位点基因型和等位基因频率、Hardy-Weinberg遗传平衡和单倍型分析；使用SPSS21.0分析上述位点与RA的关系，P<0.05定义为差异有统计学意义；对不同组间有显著差异的位点行logistic回归分析，以野生纯合型为参照，观察纯合突变和杂合突变基因型对RA发病的影响，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基因分型与测序验证 成功建立了rs3125734、rs688、rs693和rs4420638位点的PCR-HRM检测方法并完成所有临床标本的基因分型，随机抽取各位点不同基因型样本各3例进行测序验证，结果与PCR-HRM基因分型结果完全一致(图1)。

2.2RA易感性和单倍型分析 Hardy-Weinberg遗传平衡分析显示rs3125734、rs688、rs693和rs4420638位点的对照组均达到遗传平衡，具有群体代表性(P值分别为0.346、0.796、0.457和0.138)，其基因型和等位基因频率详见表2。结果显示rs3125734和rs688位点基因型和等位基因频率在两组间有显著差异(P值分别为0.046和0.016、0.014和0.020)，与兰州地区汉族人群RA易感相关；logistic回归分析显示rs3125734杂合突变型CT在两组间有显著差异(χ2=4.011,P=0.045,OR=1.613,95% CI:1.010-2.576)，是RA发病的危险因素；rs688纯合突变型TT与野生型CC在两组间有显著差异(χ2=6.853,P=0.009,OR=0.273,95% CI:0.103-0.721)，是RA的保护性因素；rs693和rs4420638位点基因型和等位基因频率在RA组和对照组间均无统计学差异(P>0.05)。LDLR基因和APOC1基因均位于19号染色体上，构建rs688和rs4420638的单倍型，结果显示单倍型CA和TA在RA组和对照组间有显著差异(P=0.020，OR=1.408，95%CI：1.054-1.881；P=5.73×10-5，OR=0.443，95%CI：0.295-0.664)，其中单倍型CA增加RA发病风险，TA降低其发病风险；单倍型TG在两组间无显著差异(P=0.651，OR=1.093，95%CI：0.745-1.603)，与RA发病无明显相关。

图1 各位点PCR-HRM基因分型和测序验证图Fig.1 PCR-HRM genotyping and sequencing figures of loci

表2各位点基因型频率和等位基因频率在RA组和对照组中的分布[n(%)]

Tab.2Distributionsoffourlocigenotypeandallelefrequenciesincaseandcontrolgroups[n(%)]

SNPsGenotype/alleleRA groupControl groupχ2P valuers693CC498(0.847)180(0.900)3.8540.146C>TCT88(0.150)20(0.100)TT2(0.003)0(0.000)C1084(0.922)380(0.950)T92(0.078)20(0.050)3.6040.058rs4420638AA467(0.794)162(0.810)0.2310.631A>GAG121(0.206)38(0.190)GG0(0.000)0(0.000)A1055(0.897)362(0.905)G121(0.103)38(0.095)0.2050.651rs3125734CC473(0.804)175(0.875)6.1440.046C>TCT109(0.185)25(0.125)TT6(0.010)0(0.000)C1055(0.897)375(0.938)T121(0.103)25(0.062)5.7930.016rs688CC414(0.704)127(0.635)8.5820.014C>TCT166(0.282)64(0.320)TT8(0.014)9(0.045)C994(0.845)318(0.795)T182(0.155)82(0.205)5.4090.020

2.3血清学指标分层分析 病例组中有anti-CCP结果者441例，RF结果376例，经两项血清学指标分层后，anti-CCP(+)RA组分别与anti-CCP(-)RA组和对照组进行统计学分析，RF(+)RA组分别与RF(-)RA组和对照组进行统计学分析，结果显示rs4420638位点基因型和等位基因频率在RF(-)RA组与对照组间有统计学差异(χ2=4.710，P=0.030；χ2=4.110，P=0.043)；logistic回归分析显示其杂合突变型AG在两组间存在显著差异(χ2=4.046，P=0.044，OR=1.799，95%CI：1.015-3.186)，表明AG基因型是RF(-)者RA发病的危险因素；rs693在各组间无显著差异(P>0.05)。将病例组分为RF(+)CCP(+)组181例、RF(-)CCP(-)组55例、RF(+)CCP(-)组31例和RF(-)CCP(+)组55例，观察各组单倍型分布情况，其中单倍型CA在四组中的频率分别为0.950、0.927、0.982和0.968，单倍型TA在四组中频率分别为0.287、0.218、0.327和0.355。

3 讨论

本研究通过自建PCR-HRM检测体系成功对788例临床样本进行rs3125734、rs688、rs693和rs4420638的基因分型，其中rs3125734与rs688兰州地区汉族人群RA易感相关。日本人群全基因组关联分析发现rs3125734位点与RA易感相关且T等位基因可增加RA患病风险[6]，与本研究结果一致。该位点是位于RTKN2基因第一个外显子上的错义突变，突变后导致组氨酸变为精氨酸，影响蛋白表达。此外，由于RTKN2基因编码的Rho-GTPase效应蛋白在CD4+T细胞高表达[13]并参与调节NF-κB通路的激活，而NF-κB通路是RA发病机制的重要环节，因此其T等位基因可通过增加NF-κB活性影响RA易感性[6]。韩国人群研究发现rs688位点与RA易感相关且T等位基因增加RA易感性[7]，与本研究结果不一致，两项研究的比对分析，发现T等位基因频率在两组对照间存在统计学差异(χ2=175.121,P<0.001)，其T等位基因可通过降低LDLR基因12外显子的剪接效率使LDLR水平降低、TC和LDL-C水平升高[10]，而血脂紊乱常与RA相伴发生[14]，这可能是易感因素之一。本研究未发现rs693和rs4420638位点基因型和等位基因频率在RA组和对照组间有统计学差异，但经血清学指标将病例组分层后发现rs4420638位点基因型和等位基因频率在RF(-)RA组与对照组间有显著差异，这与Park等[9]在韩国人群中报道rs693位点与RA易感无关而rs4420638位点与RA易感相关的结论基本一致，只是本研究中RA易感性仅在RF(-)RA患者中表现出来，该位点是APOC-I基因3′端的点突变，有可能影响编码蛋白的表达，本次研究未发现rs4420638位点的突变纯合基因型GG，这可能与样本量不足有关。查询四个位点千人基因组数据，对比CHB(中国北方人群)和CHS(中国南方人群)，其中rs3125734、rs693和rs4420638位点在两组中均无显著差异(P>0.05)，rs688位点基因型频率在两组间有统计学差异(χ2=7.167,P=0.028)，因其CHB数据不符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P=0.034)，说明不具有群体代表性，对此差异不做考虑。以本研究RA组和对照组分别与CHB、CHS、CHB+CHS组行χ2检验，结果显示P均大于0.05，无统计学差异；将CHB、CHS和本研究对照组合并后，分别与RA组行χ2检验，结果显示rs3125734的基因和基因型频率在两组间存在显著差异(χ2=6.986,P=0.008；χ2=7.002,P=0.030)。与不同人群研究数据比对发现，其基因和基因型频率与日本人和韩国人较为接近(P>0.05)，但与欧洲人群差异较大(P均<0.001)，提示其具有显著的种族差异性(欧洲和日本人群数据来自千人基因组数据库，韩国人群数据来自文献[7])。

通过血清学指标将病例组分为RF(+)anti-CCP(+)组、RF(-)anti-CCP (-)组、RF(+)anti-CCP(-)组和RF(-)anti-CCP (+)组，观察其单倍型分布情况发现单倍型CA在各组中频率较高。由于RF检测灵敏度高但特异性较低，而anti-CCP检测特异性较高，目前临床常通过二者联合诊断RA。但当两项指标均呈现阴性结果或只有其中一项显示阳性结果时，通过单倍型检测可提高RA诊断的准确性，本研究建立的方法可用于临床常规检测。

总之，本研究成功建立了RTKN2、LDLR、APOB和APOC1基因多态性的PCR-HRM检测方法，通过病例对照研究发现rs3125734、rs688和rs4420638位点在兰州地区汉族人群中RA的易感性。PCR-HRM检测方法具有普遍适用性，除本研究使用的仪器和荧光染料外，还可使用Light Scanner 32、Light Cycler 480、ABI 7500和CFX 96等仪器和LC Green、Eva Green和ResoLight等饱和荧光染料[15]。多重PCR-HRM技术近年来快速发展[12]，这一技术有望在未来实现更大通量、更快速度的检测。此外，在研究rs693与乳腺癌[16]、胆囊癌[17]和胰岛素抵抗[9]等疾病的相关性以及rs4420638与他汀类药物疗效[18]、2型糖尿病和阿茨海默病[19]发病的相关性时，上述检测体系同样适用。