三白草水提液抗肠道病毒71型作用初探①

王春阳 严琴琴 魏兰兰 贺茂芳 郑梦迪

(西安医学院，西安710021)

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，单股正链RNA病毒，是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一，其感染可以引起中枢神经系统并发症，大部分重症手足口病例是由EV71感染所致[1]。大部分EV71感染的患儿主要表现为手、足、口皮疹、疱疹，个别重症病例可以出现脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿、肺出血等并发症。目前临床上针对EV71感染的治疗主要为对症治疗和支持治疗。临床上尚没有有效的抗病毒药物以及上市的疫苗。

三白草是三白草科植物三白草Saururus chinensis(Lour.)Baill的全草，具有清热解毒，利尿消肿的功效。民间用于白带、尿路感染、肾炎水肿、外治疮疡肿毒及湿疹等疾病的治疗[2]。三白草的主要成分包括槲皮素、槲皮甙、异槲皮甙、金丝桃甙及芸香甙[3]。三白草及其活性成分被报道能够抑制NF-κB的活性进而抑制炎症因子的产生[4]。又有研究发现，三白草的主要成分槲皮素、槲皮苷等能够通过阻断NF-κB信号通路抑制疱疹病毒的感染[5，6]。然而关于三白草抗EV71病毒活性的研究尚少。EV71病毒引起的手足口病的严重程度与炎症因子的产生密切相关，而NF-κB信号通路在炎症因子的产生过程中起到了不可忽视的作用，因此本研究探讨了三白草水提物是否能够抑制EV71病毒活性以及NF-κB在此过程中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物 三白草药材购于陕西省西安市医府大药房，经西安医学院生药教研室郑梦迪教师鉴定。三白草水提物的制备：将烘干的三白草药材粉碎后，称取10.0 g，加入100 ml蒸馏水，于60℃水浴锅中孵育24 h。弃去药渣，5 000 r/min离心10 min。取上清液，浓缩至20 ml，转至减压干燥机完全干燥，用含5% DMSO的细胞维持液配成10 mg/ml母液，存于EP管中，放于-20℃冰箱备用。利巴韦林注射液(广州白云山天心制药股份有限公司，批号：120201)。

1.1.2细胞和病毒 非洲绿猴肾上皮Vero细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。细胞培养于包含高糖的热灭活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、以及非必需氨基酸的完全DMEM中。 细胞培养于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。EV71病毒(阜阳株)由江苏省疾病预防与控制中心惠赠。本单位实验室拥有完备的生物安全P2 级实验室供细胞培养。EV71在RD细胞培养扩增后分装保存于-80℃冰箱。

1.2实验方法

1.2.1细胞分组及干预方法 本实验分5组，包括空白对照组(Control)、不同浓度三白草水提液处理组、仅有EV71感染组(EV71)、不同浓度三白草水提液处理组(不同浓度三白草水提液+EV71)、利巴韦林处理组(0.31 mg/ml利巴韦林+EV71)。其中空白对照组(Control)、不同浓度三白草水提液处理组用于三白草水提物的细胞毒性检测。空白对照组(Control)、仅有EV71感染组(EV71)、不同浓度三白草水提液处理组(不同浓度三白草水提液+EV71)和利巴韦林处理组(0.31 mg/ml利巴韦林+EV71)用于三白草水提物抗EV71活性检测。空白对照组(Control)、仅有EV71感染组(EV71)和三白草水提液处理组(三白草水提液+EV71)供三白草水提物抑制炎症因子的产生的检测用。空白对照组(Control)、仅有EV71感染组(EV71)和不同浓度三白草水提液处理组(不同浓度三白草水提液+EV71)用于三白草水提物能够抑制EV71诱导的NF-κB的活化的检测。

1.2.2提取核蛋白及Western blot检测 本实验于生长良好的单层Vero细胞中加入不同浓度的三白草水提液(终浓度为0.015、0.03、0.1 mg/ml)孵育2 h，EV71以MOI为0.1感染Vero细胞，24 h后收集细胞核蛋白。设置空白对照和感染组对照。根据核质抽提试剂盒(P0027，碧云天，江苏，中国)的说明书先配好相关试剂，放于冰上备用。用PBS将细胞清洗3遍，然后用EDTA溶液处理细胞，离心收集细胞至新的EP管中，尽量吸尽上清，留下沉淀。然后根据试剂盒说明书进行核质蛋白抽提。将抽提的蛋白放于-70℃冰箱冻存。核蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，用于后续的电泳实验。电泳完之后将细胞蛋白转移到PVDF膜上，用5%的小牛血清(BSA)室温封闭1 h，然后将膜与1∶1 000稀释的一抗封闭液(anti-p65抗体货号：#8242，Cell Signaling公司；anti-actin抗体货号：#4970，Cell Signaling公司)一起孵育，4℃静置过夜。用TBST漂洗膜3次，每次10 min。再将膜与含1∶10 000稀释的二抗(sc2357CM，Santa Cruz公司)封闭液一起室温孵育2 h。TBST漂洗膜3次，每次10 min。然后将膜放于凝胶成像仪中拍照。

1.2.3实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)测定IL-6、IL-8以及IL-1β的表达 根据RNA提取试剂盒(Qiagen，Germany)说明书提取感染细胞和未感染细胞的总RNA。用美国Thermo公司的Nanodrop测定RNA的浓度与纯度。按照TaKaRa公司的2 Step Real Time RT-PCR逆转录试剂盒(RRO36A)说明书，取500 ng RNA反转录成cDNA。然后用获得的cDNA作为模版按照TaKaRa的SYBR荧光定量Real-time PCR试剂盒(RR420A)的说明书配制PCR反应液，然后在Applied Biosystems StepOnePlusTM仪器上进行荧光定量反应。PCR反应条件是：95℃预变性30 s，然后95℃ 5 s 60℃ 30 s,进行40个循环。内参基因选取磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因。每个做3个孔，每次实验重复3次。基因的表达水平按照公式2(ΔCt of Gene-ΔCt of GAPDH)进行计算。引物序列见表1。

1.2.4三白草水提物的细胞毒性检测 选择生长旺盛的单层RD细胞，用胰酶消化离心后加入DMEM培养液制成细胞悬液。用移液器将细胞悬液加入96孔板中，每孔100 μl。用含2%血清的DMEM将各中药提取物稀释2倍比稀释成10个浓度，分别加入单层RD细胞中，每个浓度设置6个复孔，同时设置空白对照、病毒对照。于37℃、5%CO2孵箱中孵育。每日将培养板置于倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察72 h。用MTT方法检测细胞活力[7]。同时设置调零孔和对照孔。读取A570，细胞存活率=A570药物/A570对照×100%。

1.2.5三白草水提物抗EV71活性检测 EV71引起的细胞病变效应可以通过MTT的方法定量检测。将不同浓度三白草水提液提前2 h加入生长旺盛的单层Vero细胞培养液中，然后EV71以MOI为0.1感染Vero细胞24 h。一方面用MTT测定细胞活力，读取A570值，利巴韦林为阳性对照。按公式计算细胞相对于对照的存活率；另一方面收集上清液，用TCID50的方法测定病毒滴度，以确定三白草水提液对EV71子代病毒释放的影响。

1.2.6病毒滴度的测定 将消化悬浮的Vero细胞接种于96孔细胞培养板内，培养12～16 h。取10个EP管，每管各加入90 μl的无血清DMEM。将病毒原液吹打均匀后吸取10 μl加入到第一管中，用枪头上下吹打混匀，从第一管中吸取10 μl加入第二管，上下吹打混匀，以此类推逐个稀释至10-8，每一次稀释都要更换枪头。然后将各稀释度的病毒加入到已培养好的Vero细胞中，每个稀释度接种8个孔，每个孔10 μl。观察并记录细胞病变情况。按照Reed-Muench方法[8]，计算TCID50。

1.3统计学处理 采用SPSS统计软件进行双尾学生t检验统计学分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

表1引物序列

Tab.1Primerssequence

Gene namesForward primerReverse primerβ-actinATGGATGACGATATCGCTGATGAGGTAGTCTGTCAGGTIL-1βGGACAAGCTGAGGAAGATGCTCGTTATCCCATGTGTCGAAIL-6AAAGAGGCACTGGCAGAAAATTTCACCAGGCAAGTCTCCTIL-8GTTCCACTGTGCCTTGGTTTGCTTCCACATGTCCTCACAA

2 结果

2.1三白草水提物的细胞毒性检测 MTT实验结果显示，三白草水提物在0.1 mg/ml的浓度下细胞活力与对照组相差无几(图1)，说明三白草水提物在此浓度以内对Vero细胞生长没有明显的毒性和抑制作用。

2.2三白草水提液抗EV71作用 分别用不同浓度的三白草水提液预处理Vero细胞2 h，然后EV71以MOI为0.1感染细胞24 h，利巴韦林作为阳性对照。应用MTT实验检测细胞活力，三白草水提物在0.1、0.03、0.015 mg/ml的浓度下的细胞活力结果表明，与对照相比，三白草水提物在0.1、0.03、0.015 mg/ml的浓度下能够显著提高细胞的存活率(P值分别为0.031 1、0.001 6、0.001 8)表明其能够显著抑制EV71感染诱导的细胞死亡，并且这种抑制作用具有剂量依赖性(图2A)。阳性对照利巴韦林也能够显著抑制EV71诱导的细胞死亡(P值为0.000 6)。收集细胞上清液，检测病毒滴度发现(图2B)，与病毒组相比，三白草水提液在0.1、0.03以及0.015 mg/ml的浓度下分别将病毒滴度降低了1.60 logs、1.85 logs和3.45 logs(P值分别为0.020 5、0.050 9、0.003 9)，利巴韦林将病毒滴度降低了3.54 logs(P值为0.003 8)。以上结果说明三白草水提物能够抑制EV71子代病毒释放的影响，并且在0.1 mg/ml的浓度下，具有与阳性对照利巴韦林相当的抗病毒作用。

2.3三白草水提物抑制炎症因子的产生 病毒感染能够诱导炎症因子的产生。据报道，EV71感染能够诱导大量炎症因子的产生，比如IL-1β、IL-6以及IL-8[9]。这些炎症因子与疾病的严重程度明显相关[10-12]。提前用0.1 mg/ml的三白草水提物处理细胞2 h，EV71感染Vero细胞24 h后提取RNA，应用Realtime PCR的方法检测IL-1β、IL-6以及IL-8的mRNA的表达。

图1 三白草水提物的细胞毒性检测Fig.1 Determination of cytotoxicity of water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill on Vero cells

图2 三白草水提液抑制EV71感染Fig.2 Inhibition of EV71 infection by water extracts of Saururus chinensis(Lour.)BaillNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

图3 三白草水提物抑制炎症因子的产生Fig.3 Water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill inhibited expression of cytokines induced by EV71 infectionNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

图4 三白草水提物能够抑制EV71诱导的NF-κB的活化Fig.4 Water extracts of Saururus chinensis(Lour.)Baill blocked nuclear translocation of p-65/NF-κB during EV71 infectionNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

结果表明，三白草水提液能够明显降低EV71诱导的IL-1β、IL-6以及IL-8的mRNA的表达(P值分别为0.005 5，0.010 1，0.056 8)，说明三白草能够抑制炎症因子的产生(图3)。

2.4三白草水提物能够抑制EV71诱导的NF-κB的活化 EV71感染能够诱导NF-κB的活化，并且NF-κB信号通路在炎症因子的产生过程中起着重要作用。NF-κB的活化与否可以通过检测p-65的核转位情况。为此，我们检测了三白草水提物是否对p65的入核过程有影响。EV71感染24 h后明显诱导了p-65的核转位(图4)。通过3次重复试验，计算NF-κB进核相对于对照的比值，结果发现三白草水提物0.015、0.03、0.1 mg/ml以及EV71的NF-κB进核的相对比值分别为1.323、2.267、2.218、3.699，提示三白草水提物在0.015、0.03、0.1 mg/ml的浓度下能够明显降低EV71诱导的p-65的核转移(P值分别为0.002 7、0.014 6、0.042 2)。以上结果说明三白草水提物预处理细胞能够抑制NF-κB信号通路的活化。

3 讨论

EV71目前被认为是继脊髓灰质炎病毒后又一个最重要的噬神经性肠道病毒，因而引起国内外广泛关注。EV71感染的治疗目前主要是对症治疗和支持治疗。2011年的手足口病诊疗指南上推荐的利巴韦林虽然有一定疗效，但是因毒副作用大，患者长期使用会导致多个系统并发症，尤其是血液系统，例如贫血，从而造成机体损伤[13]。鉴于EV71感染尚无有效的抗病毒药物和上市的疫苗，寻找安全有效的中药抗病毒成分就显得格外迫切。

三白草属于三白草科植物，三白草科植物有抗炎、清热、解毒的功能，民间主要用于治疗火淋，黄疸、湿疹等。通常抗炎清热解毒类中草药可以通过影响病毒的复制和代谢过程起到直接杀死病毒或者抑制病毒生长的作用，目前关于其抗病毒作用报道较少。仅有学者报道三白草水提物可以抑制HSV-2 病毒复制，其机制与抑制病毒复制所需的NF-κB 通路活化有关[14]。EV71属于微小病毒科，肠道病毒属。现如今尚缺乏关于三白草抗EV71或其他肠道病毒活性的相关报道。我们前期研究发现，三白草科植物的另一个植物鱼腥草，能够显著抑制EV71的感染和炎症因子的产生[8]。本研究通过EV71体外感染模型，发现三白草科植物三白草水提物也能够明显抑制EV71病毒的复制。鱼腥草和三白草同属三白草科，二者都具有抗炎的作用，而EV71感染的手足口患儿疾病的严重程度与炎症因子的产生密切相关，因此这两种植物可能都是通过发挥抗炎作用达到缓解EV71感染的作用。三白草水提液在0.1、0.03、0.015 mg/ml的浓度下能够显著抑制EV71感染诱导的细胞死亡和子代病毒的释放，并且这种抑制作用具有剂量依赖性(图2)。据报道，炎症因子的产生，尤其是IL-6，在EV71的致病过程中起到重要作用，并且针对炎症因子的靶向治疗可以明显减少神经元的死亡及脑组织的炎性损伤[15]。NF-κB能够被病毒感染所激活，并参与炎症因子的产生。我们进一步研究发现，三白草水提液能够明显降低EV71感染诱导的炎症因子的表达，并且能够显著抑制EV71对NF-κB的活化作用，进而抑制NF-κB介导的炎症因子的产生。三白草的主要成分包括槲皮素、槲皮甙、异槲皮甙、金丝桃甙及芸香甙[3]。据报道，三白草及其活性成分有抗炎和抗病毒的活性。究竟三白草中哪个活性成分起到了抗病毒的作用以及抗炎的作用仍需要进一步的研究。三白草水提液在0.1 mg/ml的浓度下，具有与阳性对照利巴韦林相当的抗病毒作用。赵瑞玲等[13]学者通过对利巴韦林临床应用进行安全性评价发现，利巴韦林应用后不良反应复杂多样，累及多个系统，以血液系统最为常见。而三白草目前尚未见到相关不良反应的报道，安全性较好。以上结果提示三白草水提液一方面能够抑制EV71病毒的复制，一方面能够阻断NF-κB介导的炎症因子的产生，从而为将来EV71感染的病毒研发，提供理论基础。