雌激素调节Th17/Treg细胞免疫平衡抑制肾脏缺血再灌注损伤①

张 洋 冀 伟 周奥飞 常越辰 张 亮 马克涛 李 丽 司军强 王 洋

(石河子大学医学院生理教研室，石河子832002)

肾脏缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)通常发生在肾大部切除、肾移植和主动脉-血管手术等临床情况下，是造成急性肾衰竭(Acute renal failure,ARF)的常见原因，也是肾移植预后的重要影响因素[1]。以往研究发现，IRI作为一种急性的组织损伤病变，能够刺激和兴奋固有免疫系统，激活其中的抗原非特异性免疫细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞等)并产生相应的免疫应答反应[2,3]。近年来研究发现，作为经典的适应性免疫细胞——CD4+T淋巴细胞被认为是连接固有免疫和适应性免疫的重要桥梁，参与和介导了肾脏IRI[4-6]。CD4+T淋巴细胞不仅包括Th1和Th2细胞，还包括新定义的Th17和Treg细胞[7,8]，研究发现Th17/Treg的免疫稳态破坏是很多自身免疫性和炎症性疾病发生发展的关键因素[9,10]。

类固醇激素尤其是性激素在各种炎性疾病中发挥着重要作用[11,12]。人体和动物实验已发现，女性比男性更易耐受由IRI引起的肾损伤，说明雌激素在IRI引起的肾脏炎性过程中扮演着重要角色，且其作用机制复杂[13,14]。雌激素是否通过调节Th17/Treg的免疫平衡来抑制肾脏炎症反应，尚未见报道。因此，本研究将从Th17/Treg免疫平衡的角度，以去卵巢大鼠为研究对象，进一步探讨雌激素对肾脏IRI的免疫调控机制，为临床上治疗肾脏IRI提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器 E2(Sigma,美国)；红细胞裂解液(BD,美国)；FITC标记的抗大鼠CD3单克隆抗体、APC标记的抗大鼠CD4单克隆(eBioscience，美国)；FACSAriaⅢ型流式细胞仪(BD,美国)；大鼠IL-17 ELISA Kit、大鼠IL-10 ELISA Kit(Elabscience，中国)。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组 健康清洁级雌性SD大鼠24只，体质量220～300 g，8～12周龄，由新疆医科大学实验动物中心提供(许可证编号 SCXK 新2003-0001)。购进大鼠后先进行为期1周的适应性饲养，饲养温度为20～25℃，湿度为50%～55%，所有大鼠均自由饮水摄食。24只雌性SD大鼠随机分为4组：对照组(Control group)、去卵巢组(OVX group)、去卵巢后缺血再灌注损伤组(OVX+IRI group)和雌激素干预组(OE+IRI group)。

1.2.2模型制备 去卵巢模型制备和雌激素干预：将除Control group之外的18只SD大鼠以30 mg/L戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，经鼠背面切口切除双侧卵巢，手术后恢复14 d，在此期间要做好大鼠伤口的消毒和垫料清洁等工作，防止伤口感染。自术后14 d，将其中的6只SD大鼠皮下给予E2干预(100 μg/kg·d)，连续3 d，并做好标记。

1.2.3肾脏缺血再灌注损伤模型制备 各组SD大鼠分别于末次给药30 min后，再次用30 mg/L戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后按照本实验室常用方法[15]切除右侧肾脏，用无创动脉夹夹闭左侧肾蒂，持续缺血45 min后，恢复血流。各组分别于连续再灌注6 h后取血，剥离肾脏组织。

1.2.4全血生化指标检测 各组大鼠待肾脏缺血再灌注6 h后，予以30 mg/L的成巴比妥腹腔注射，麻醉成功后，行腹主动脉穿刺取全血，送往石河子大学医学院第一附属医院检验科采用ROCHE罗氏COBASINTEGRA 800全自动血生化分析仪进行血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(Serum creatinine,SCr)检测，评估其肾功能变化。

1.2.5肾脏病理学检测 将再灌注6 h后剥离的肾脏组织经固定、包埋、切片后行常规HE染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理形态学的变化，并由两名专业的病理科医师对其进行Paller评分。

1.2.6流式细胞术检测外周血CD3+CD4+T细胞变化 ①在5 ml EP管中分别加入100 ml抗凝全血，设立单标管和同型对照管，加入抗体(FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD25)1 μl，于常温下避光孵育20 min。②加入1×红细胞裂解液2 ml裂解红细胞8～10 min。③裂红结束后加入1 ml PBS终止裂解。③于1 000 r/min离心5 min，离心后弃掉上清，用500 μl的PBS重悬细胞后，上流式细胞仪进行检测。

1.2.7炎症因子IL-17和IL-10的表达 取冻存于-20℃的血清样品， ELISA法检测 IL-17 和 IL-10 表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1雌激素对肾功能的影响 正常大鼠BUN和SCr的水平分别为(6.35±1.26) mmol/L和(30.27±4.82) μmol/L。OVX+IRI组BUN和SCr的水平升高，明显高于OVX组(21.85±3.54 vs 7.15±1.41;115.16±13.27 vs 34.31±6.64)，差异有统计学意义(P<0.01)。而OE+IRI组BUN和SCr的水平显著降低，明显低于OVX+IRI组(15.08±2.89 vs 21.85±3.54;68.89±12.65 vs 115.16±13.27)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2雌激素对肾脏病理组织结构的影响 HE病理染色显示，Control组和OVX组肾小球肾小管清晰可见，未见明显的形态学改变；OVX+IRI组近端及远端肾小管明显扩张，部分上皮细胞的核碎裂坏死、脱落，刷状缘脱落，肾小管管腔阻塞，有大量的蛋白管型，肾小球血管管腔闭塞，肾间质有大量的炎性细胞浸润；OE+IRI组肾小管轻度扩张、细胞水肿、蛋白质管型、肾间质炎性浸润均明显减轻，刷状缘有损害但损害较轻(图1A)。采用Paller评分方法计算肾脏病理组织评分[16]，结果显示OVX+IRI组Paller评分显著高于OVX组(45.67±2.99 vs 11.33±2.50)，差异有统计学意义(P<0.01)；而OE+IRI组Paller评分显著低于OVX+IRI组(31.17±3.96 vs 45.67±2.99)，差异有统计学意义(P<0.05),见图1B。

2.3雌激素对外周血中CD3+CD4+T细胞表达的影响 流式细胞术检测结果显示，与OVX组比较，OVX+IRI组中CD3+CD4+T细胞的比例显著增高(76.23±2.40 vs 64.95±5.42)，差异有统计学意义(P<0.01)；经雌激素补充治疗后OE+IRI组中CD3+CD4+T细胞的比例显著降低(69.75±2.56 vs 76.23±2.40)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

表1各组大鼠血尿素氮和血肌酐的水平

Tab.1Bloodureanitrogenandserumcreatininelevelsineachgroup

GroupsBUN(mmol/L)SCr(μmol/L)Control6.35±1.2630.27±4.82OVX7.15±1.4134.31±6.64OVX+IRI21.85±3.542)115.16±13.272)OE+IRI15.08±2.891)2)68.89±12.651)4)

2.4雌激素对细胞因子IL-17和IL-10表达影响 OVX+IRI组大鼠血清中 IL-17的表达浓度显著高于OVX组大鼠(1066.79±99.37 vs 434.09±162.69)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.01)， 而IL-10的表达浓度显著低于OVX组大鼠(33.27±11.06 vs 81.47±24.29)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)；经雌激素补充治疗后OE+IRI组中IL-17的浓度显著降低(643.14±270.74 vs 1 066.79±99.37)，差异有统计学意义(P<0.01)，而IL-10的浓度显著升高(65.36±16.12 vs 33.27±11.06)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.5细胞因子IL-17和IL-10与肾脏损伤指标的相关性分析如图4A～C所示，肾脏缺血再灌注损伤中IL-17的表达水平与肾功能指标BUN(r=0.691,P=0.000)、Scr(r=0.721,P=0.000)和肾小管Paller评分(r=0.769,P=0.000)均呈现正相关性。

图1 各组大鼠肾脏组织病理学变化Fig.1 Renal histopathological changes of rats in each groupNote: A.Pathological images of kidney in each group(HE staining,bar:200 μm)；B.Paller score bar graph of HE staining of kidney in each group.*.P<0.05,**.P<0.01 vs OVX group；#.P<0.05 vs OVX+IRI

图2 各组大鼠外周血中CD3+CD4+ T细胞的表达水平Fig.2 Expression of CD3+CD4+ T cells in peripheral blood of rats in each groupNote: A.Representative flow cytometric scatter plot of CD3+CD4+ T cell expression；B.Bar graph of the positive expression rate of CD3+CD4+ T cells in each group.*.P<0.05,**.P<0.01 vs OVX group；##.P<0.01 vs OVX+IRI

图4 血清中炎症因子IL-17和IL-10分别与BUN、SCr和Paller评分的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of serum IL-17 and IL-10 levels with BUN,SCr and Paller scoresNote: The concentration of IL-17 were positively correlated with BUN(A),Scr(B) and (C)Paller score.The concentration of IL-10 were negatively correlated with BUN(D),Scr(E) and (F)Paller score.Each symbol represents a single individual(n=6).

图3 ELISA检测各组大鼠血清中IL-17和IL-10的表达水平Fig.3 Serum levels of IL-17 and IL-10 in each group were detected by ELISANote: A.IL-17 was measured in serum taken at 6 h post reperfusion；B.IL-10 was measured in serum taken at 6 h post reperfusion.*.P<0.05,**.P<0.01 versus OVX group；#.P<0.05,##.P<0.01 vs OVX+IRI

而IL-10的表达水平与肾功能指标BUN(r=-0.603,P=0.002)、Scr(r=-0.519,P=0.009)和肾小管Paller评分(r=-0.556,P=0.005)均呈现负相关性(图4D～F)。

3 讨论

肾脏IRI的发病机制十分复杂，涉及钙超载、氧化应激、微循环障碍、内皮功能紊乱和过度炎症反应等[17]，目前在临床上尚缺乏有效的防治手段。许多研究表明IRI存在性别差异，男性比女性更易发生IRI。流行病学和Meta分析显示女性绝经期后由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，较易发生心、脑、肾的IRI。因此，雌激素替代疗法已经成为一种新兴的防治IRI的方法[18,19]。本研究采用经典的围绝经期模型——去卵巢大鼠模型为研究对象，实验结果显示，OVX+IRI组中BUN、SCr和肾小管Paller评分均高于OVX组；而补充雌激素至正常水平后，上述指标均下降。说明雌激素可以通过调节肾功能和改善肾组织损害程度对肾脏IRI起到保护作用，此结果与以往的研究一致[20]。

肾脏IRI是一种由适应性免疫和固有免疫共同介导的炎性疾病[21]。有研究表明，CD4基因敲除的小鼠，可以耐受由IRI诱导的肾损伤，而CD8基因敲除的小鼠却无此作用，由此可知CD4+T细胞是其致病的关键因素[22,23]。因此，靶向干预CD4+T细胞成为近年来研究的热点。本研究同样发现，肾脏IRI后外周循环中CD3+CD4+T细胞比例升高，肾脏损伤加剧。以往研究发现，雌激素可通过抗氧化、抗凋亡等途径，减少再灌注区中性粒等细胞的浸润及炎症因子的分泌，对脑、肾等器官的IRI具有保护作用[19,24]。本研究发现经雌激素补充治疗后，外周循环中CD3+CD4+T细胞比例降低，肾损伤减轻，说明雌激素也可通过降低外周循环中的CD3+CD4+T细胞的表达从而减轻由IRI诱导的炎症反应。然而CD4+T细胞亚群在肾脏缺血再灌注损伤中的作用及雌激素对CD4+T细胞亚群的影响尚不明确。

在炎症因子的作用下，CD4+T淋巴细胞可分为不同种类的辅助性T细胞。最初人们认为在肾损伤时，Th1细胞被活化并加剧炎症反应，而Th2细胞则对肾急性损伤具有保护作用，Th1/Th2的平衡在肾脏IRI的发生发展中发挥着重要作用[25,26]。近年来汪泉等[27]研究发现，在一些肾损伤模型(如肾小球肾炎、狼疮肾炎和IRI)中，外周循环中的Th17细胞及其细胞因子被激活[28]。Treg细胞是CD4+T淋巴细胞的另一种辅助性T细胞，可抑制过度免疫反应。研究发现，CD4+CD25+Treg细胞可通过直接接触或释放抗炎细胞因子(如IL-10和TGF-β1)，来维持免疫耐受从而对抗由IRI诱发的肾脏炎性反应[29]。此外，在肝脏IRI中，CD4+CD25+Treg细胞可通过负性调控Th17细胞的生成、功能及IL-17的分泌来发挥其抗炎作用[30]。众多研究表明Th17/Treg的免疫平衡破坏是导致炎性免疫相关性疾病、自身免疫性疾病、中枢炎性疾病、器官移植等疾病发生发展的关键因素[31]。本研究结果显示：在OVX+IRI组中，Th17细胞所分泌的炎症因子IL-17浓度升高，CD4+CD25+Treg所分泌的炎症因子IL-10的浓度下降，提示Th17/Treg平衡存在失衡，肾损伤加剧。此外，相关性分析结果显示：IL-17与肾损伤相关指标呈现正相关性，IL-10则呈现负相关性，提示该免疫平衡与肾脏IRI同步、关联，此免疫调节失衡进一步导致机体过度炎症反应的持续存在，使IRI的易感性增加。

Patil等[6]研究表明，减少IL-17细胞因子的分泌，能够减弱心肌、肺及肾组织的IRI诱导的炎症反应，提示靶向抑制Th17细胞，阻断其细胞因子IL-17的分泌可减轻由IRI诱发的炎症级联反应[32]。Koo等[30]研究发现，运用P2X7受体拮抗剂可通过扩增Treg的表达进而促进肾损伤的恢复。因此，通过对Th17/Treg多层面的免疫干预，维持Th17/Treg的免疫平衡，可能具有抑制由缺血肾组织诱发的局部炎症及全身炎性反应的作用，从而减轻肾脏IRI。本实验发现，雌激素可通过降低IL-17细胞因子的分泌，靶向抑制Th17细胞的活化，通过提升IL-10细胞因子的分泌，靶向激活CD4+CD25+Treg细胞，从而调节Th17/Treg的免疫平衡，降低由IRI诱导的炎性损伤。

综上所述，肾缺血再灌注损伤后大鼠体内可能存在着Th17/Treg稳态的破坏，Th17/Treg免疫稳态随着肾损伤相关指标变化而改变，表明该免疫稳态与肾缺血再灌注损伤的发生发展密切相关；雌激素可通过调节和维持Th17/Treg的稳态，有望成为治疗肾脏IRI的新靶点。