偏侧咀嚼对大鼠髁突软骨细胞中IRE1和caspase-12的影响

程 洁 田丛娜 尉 静 吴永生 谷建琦 康 林

颞下颌关节骨关节病（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ OA）是以关节软骨的破坏与耗损为主要特征，伴发软骨下骨组织改建和滑膜相应病变的一种退行性疾病[1]，是颞颌关节紊乱综合征中最常见的类型之一，其临床表现为关节弹响、疼痛和运动受限，其病因复杂，但大多数学者认为压力负荷过大是其主要病因[2，3]。TMJ OA的病理学特征表现为软骨的退化，软骨下骨改建和滑膜组织的慢性炎症，但其发病机制尚需进一步研究[4，5]。TMJ受到牵张力、压力，剪切力等外界刺激时，应力如果超出生理性范围，髁突软骨内软骨细胞及其外周细胞基质的代谢平衡则会被打破，引起细胞增殖的加强或细胞凋亡的趋势[6，18]。IRE1是内质网跨膜蛋白，caspase-12是内质网凋亡通路特有的凋亡因子，当外界刺激所致的内质网应激反应启动后，IRE1通过内质网通路经过一系列的级联反应激活caspase-12，引起细胞凋亡反应。本实验通过对大鼠单侧咀嚼的造模，研究髁突软骨细胞中由内质网应激介导的内质网凋亡通路中的关键蛋白IRE1和caspase-12的表达变化。

资料和方法

1.实验动物的选择与分组：使用河北医科大学动物中心提供的3周龄雄性SD大鼠48只，适应性饲养一周后，随机分为8组，实验组及对照组各4组，每组6只。

2.动物模型的建立与取材：各实验组大鼠经10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉后，固定头部，拔除左侧上、下颌所有磨牙，拔牙后1d，7d，14d，28d处死。完整取材双侧髁突软骨组织，立即于-80℃冰箱保存。对照组大鼠不做拔牙处理，与对应实验组同期处死。

3.下颌运动方式的观察：观察大鼠静止时的上、下颌中线位置是否一致，拔牙处理后，观察拔牙大鼠咀嚼时下颌的运动方式，下颌切点运动时偏向左侧和右侧的频率。

4.实时定量PCR检测：取双侧髁突软骨，于-80℃保存，用Trizol提取组织样本中总RNA。取5μlRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT进行反转录为cDNA，实验操作按产品说明书进行。设计引物序列进行扩增，β-actin用作内定参考。PCR 反应程序：95℃15min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循环40次。分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60℃～95℃进行溶解曲线分析，引物序列见表1。

用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。根据RealTimePCR原始检测结果，按照 2-△△ct相对定量计算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（实验组）－CtBeta基因（实验组）]-[Ct目的基因（对照组）－CtBeta基因（对照组）]。计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异。

表1 PCR引物序列

5.统计方法：采用SPSS 19.0统计软件中单因素方差分析法，比较不同时间点实验组左、右侧及对照组髁突软骨IRE1和caspase-12的表达情况及各实验组内同侧不同时间点的IRE1和caspase-12的表达情况。

结 果

1.下颌切点运动轨迹的观察：对照组大鼠在静止时，上、下中线一致，咀嚼时下颌切点运动轨迹向左侧和右侧偏向的频率基本相等。实验组大鼠静止时上、下颌中线基本一致，咀嚼时下颌切点的运动轨迹明显偏向右侧（非拔牙侧）。

2.RT-PCR检测结果：因对照组髁突软骨中IRE1和caspase-12的含量在不同时间点的左右侧对比均无统计学差异（P＞0.05），所以将不同时间点对照组的左、右侧合并为一组。实验组左侧IRE1的含量在1d，7d，14d，28d时均高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05），实验组右侧IRE1含量1d，7d，14d时高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），实验组左、右侧1d时IRE1含量无显著性差异（P＞0.05），在 7d，14d，28d 均有统计学差异（P＜0.05）。随时间延长，对照组IRE1含量无明显变化（P＞0.05），实验组左侧含量逐渐升高（P＜0.05），而实验组右侧IRE1含量逐渐降低，到28d时与对照组已无统计学差异（图1）。caspase-12的变化趋势与IRE1相同，实验组左侧caspase-12含量在1d，7d，14d，28d时均高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05），实验组右侧caspase-12含量在1d，7d，14d，28d时均高于对照组， 1d，7d，14d时差异有统计学意义（P＜0.05）。随时间延长，对照组caspase-12含量无明显变化，实验组左侧含量逐渐升高，在14d，28d时升高较前一时间点有统计学差异（P＜0.05），而实验组右侧caspase-12含量逐渐降低，在7d，28d时降低较前一时间点有统计学差异（P＜0.05），28d时与对照组无统计学差异（P＞0.05）（图 2）。

图1 拔牙后IRE1含量变化

图2 拔牙后caspase-12含量改变

讨 论

颞下颌关节（TMJ）作为人体唯一保持终身改建能力的关节，其所承受的负荷与改建活动密切相关，而咬合力的改变则是TMJ负荷变化的直接来源。牙齿缺失后，咬合接触面积及保留牙齿的咬合力的改变产生不同的应力，这种应力改变沿下颌骨的应力轨迹传导至髁突软骨，打破了髁突软骨内的细胞代谢平衡。有实验研究表明[7，10]，生理性的力学刺激促进细胞增殖，胶原合成代谢、血管再生活跃，软骨厚度增加，而过大或过小的力学刺激，则会诱导细胞凋亡增加，进一步导致骨关节炎症状的出现。不同的机械力刺激，髁突软骨中所含的各种不同类型的胶原的含量比例也会改变，以适应新的力学环境[5，8]。已有很多学者对双侧TMJ受力不均衡时引起的髁突软骨组织形态学和细胞及基质代谢的变化做了研究，这些研究大多选用的发育期大鼠，因此对我们进一步研究髁突的生长发育及其影响因素都有很多帮助[9，17]。本实验中实验组大鼠左侧上、下颌所有磨牙缺失，对下颌切点运动轨迹的观察结果与李波[11]等建立的大鼠偏侧咀嚼习惯模型的结果一致。

内质网是细胞内精确的膜系统，是蛋白质合成和运输的重要场所[12]，也是细胞凋亡反应中的重要环节之一。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），是指在缺氧，氧化应激，异常糖基化反应以及钙离子稳态失衡情况下，内质网内错误折叠与未折叠的蛋白质会明显增多，当超出内质网处理能力时，细胞会激活一些相关信号级联反应，来应对条件的变化和恢复内质网良好的蛋白质折叠环境。因此内质网应激对于增强细胞对损伤的抵抗和适应能力有重要意义，对细胞的存亡有重要影响。内质网应激主要存在三种信号通路：未折叠蛋白反应（UPR），内质网超负荷反应（EOR），固醇调节级联反应。UPR对内质网最初是一种保护机制，既减少蛋白蛋白质合成，从而减少内质网负担，还可促进伴侣蛋白如GRP78、钙联接蛋白、Bip、CHOP等的表达。IRE1是一种内质网跨膜糖蛋白，具有丝氨酸、苏氨酸受体蛋白激酶活性和核糖核酸内切酶活性，能识别未折叠蛋白的蓄积，是UPR中的重要通路，可跨过内质网膜进行UPR信号传递。caspase-12是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，位于内质网的胞浆面，内质网应激可激活caspase-12，进而引起细胞凋亡反应。

本研究结果显示实验组左侧的IRE1和caspase-12含量明显高于对照组。正常状态下，发生UPR时，IRE1蛋白形成二聚体，激活IRE1蛋白激酶活性并发生磷酸化，磷酸化激活IRE1的核酸内切酶活性，进而诱导分子伴侣蛋白如BIP、CHOP、GRP78等和折叠酶基因的表达，加快蛋白折叠和错误蛋白降解。当实验组左侧磨牙缺失后，大鼠左侧髁突软骨缺乏正常的应力刺激，细胞内的代谢平衡被破坏，随着时间推移，检测出的凋亡相关蛋白含量的显著升高。这一结果说明当未折叠蛋白或错误折叠蛋白增多即产生内质网应激时，IRE1与内质网上的伴侣分子蛋白解离，IRE1自身磷酸化，刺激传导内质网死亡信号的激活，内质网的凋亡机制较为特殊，可特异性的激活caspase-12，caspase-12进而激活caspase-9，caspase-9激活caspase-3，进入最终细胞凋亡通路。而实验组右侧的IRE1和caspase-12含量在1d、7d组显著高于对照组，但随时间的延长，这两种凋亡相关蛋白均出现了逐渐下降的趋势，分析其原因可能是开始的凋亡因子含量的增高与拔牙后的创伤导致的炎性反应有关，且突然增加的过大的应力负荷会引起颞下颌关节骨关节病样改变[13]，表现为软骨的退化。而随时间推移，右侧的髁突软骨发生了适应性改建，细胞的凋亡反应逐渐减少，IRE1和caspase-12含量也随之降低。这一结果也与以往的研究结果基本一致[14～16]，缺乏正常应力刺激对发育期大鼠髁突软骨的细胞增殖无显著性改变，但对细胞凋亡有明显的促进作用，进而影响髁突的正常发育。本实验结果中，IRE1和caspase-12含量的变化，也证明内质网应激介导的细胞凋亡通路是髁突软骨细胞凋亡的重要机制之一。