miR-27a、miR-27b 和miR-378在不同猪种皮下脂肪中的差异表达研究

陶 璇，顾以韧，杨雪梅，梁 艳，钟志君，杨跃奎，曾 凯，陈晓晖，王 言，龚建军，应三成，王 卫，吕学斌

（1. 四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都610066；2. 成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都 610106）

miRNA是一类长度约22 个核苷酸的内源性非编码单链RNA，在细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生等基本生物过程中起着重要作用，是基因表达的重要调控因子[1]。研究发现，miR-27a和miR-27b在细胞中过表达能够降低脂蛋白酯酶（Lipoprotein Lipase，LPL)基因的表达量，进而抑制甘油三酯的积累以及脂肪生成基因的表达[2-3]；miR-378在脂肪组织中影响脂肪的生成，在细胞中过表达可引起脂肪代谢基因表达上调[4-6]。脂肪组织不仅是动物机体能量储存的一种形式，还参与调节包括食欲和能量消耗等多个机体功能，且对繁殖、炎症和免疫反应等多个复杂的生理过程也有重要调控作用[7]。研究猪的脂肪代谢不仅有利于改善其胴体和肉质性能，还有助于推动人类肥胖和代谢性疾病的研究。

本研究采用QRT-PCR技术检测了7个猪种背部皮下脂肪组织中miR-27a、miR-27b和miR-378的差异表达，以期为探明不同猪种脂肪沉积能力及肉质差异形成的分子机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验猪均由四川省畜牧科学研究院种猪科研基地提供。7个猪种包括引进猪种大约克夏猪和6个四川省地方猪种（丫杈猪、内江猪、青峪猪、雅南猪、成华猪、藏猪），每个猪种随机选取3头30日龄健康断奶仔猪，共21头，同一时间开始组建群体，相同品种同栏饲养，采用相同的营养水平和饲喂方式，达到6月龄进行屠宰，屠宰前停食24 h，自由饮水。屠宰后迅速采集倒数3～4肋骨间对应处的背部皮下脂肪组织和背最长肌。

1.2 实验方法

1.2.1 表型指标测定 瘦肉率、平均背膘厚按《猪胴体性状测定技术规范》（NY/T 825-2004）的方法测定并计算，单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量按《肉与肉制品脂肪酸测定》（GB/T 9695.2-2008）的方法测定。

1.2.2 总RNA提取和QRT-PCR 脂肪组织的RNA按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen， China)的操作说明书提取，QRT-PCR 采用 miScript ⅠⅠ RT Kit （Qiagen，China）根据操作说明将RNA转录成cDNA，采用miScript SYBR®Green PCR Kit （Qiagen，China） 在 CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）仪器上进行荧光定量检测，每个反应体系20 μL。5S、18S和U6作为miRNA定量的内参基因，引物信息见表1。所有目的miRNA定量结果均通过熔解曲线分析验证PCR产物的特异性，确保产物无引物二聚体，每个样本重复3次，每次检测含3个阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算目的miRNA的相对表达量。

1.3 统计分析 采用SigmaPlot 12.5软件对性状指标和基因相对表达量进行统计分析（ANVOA），结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 胴体及肉质性状测定 由表2可知，在7个猪种中，大约克夏猪瘦肉率最高，丫杈猪其次，青峪猪最低，6个地方猪种之间的瘦肉率差异不显著（P＞0.05），但均极显著低于大约克夏猪（P＜0.01）；大约克夏猪平均背膘厚最小，雅南猪其次，内江猪最大，大约克夏猪平均背膘厚显著或极显著小于雅南猪（P＜0.05）、内江猪和藏猪（P＜0.01），6个地方猪种中，雅南猪平均背膘厚显著小于内江猪、青峪猪和藏猪（P＜0.05）；单不饱和脂肪酸含量丫杈猪最高，青峪猪其次，大约克夏猪最低，显著低于除雅南猪之外的其余5个地方猪种（P＜0.05），6个地方猪种中，丫杈猪、青峪猪的单不饱和脂肪酸含量极显著高于雅南猪（P＜0.01）；大约克夏猪的多不饱和脂肪酸含量极显著高于地方猪种（P＜0.01），6个地方猪种间差异不显著（P＞0.05）。

表1 引物信息表

表2 不同猪种相关胴体及肉质性状测定结果

2.2 3种miRNA的表达水平 由图1可知，大约克夏猪miR-27a相对表达量显著高于丫杈猪、雅南猪、藏猪（P＜0.05），极显著高于内江猪、青峪猪、成华猪（P＜0.01）；6个地方猪种间miR-27a相对表达量差异不显著（P＞0.05），其中雅南猪最高，内江猪最低；大约克夏猪miR-27b、miR-378相对表达量均极显著高于6个地方猪种（P＜0.01）；地方猪种中，雅南猪miR-27b、miR-378相对表达量最高，丫杈猪miR-27b相对表达量最低，成华猪和内江猪miR-378相对表达量最低；雅南猪miR-27b相对表达量显著高于丫杈猪和内江猪（P＜0.05），青峪猪、雅南猪、成华猪与藏猪这4个地方猪种间的miR-27b相对表达量差异不显著（P＞0.05），地方猪种间miR-378相对表达量差异也不显著（P＞0.05）。

图1 不同猪种背部皮下脂肪miR-27a、miR-27b、miR-378表达水平

2.3 3种miRNA的表达水平与胴体、肉质相关性状的相关性 由表 3可知，miR-27a、miR-27b、miR-378在背部皮下脂肪中的表达水平与瘦肉率、多不饱和脂肪酸含量均呈极显著正相关（P＜0.01），与平均背膘厚呈负相关（P＞0.05）；miR-27b在背部皮下脂肪中的表达水平与单不饱和脂肪酸含量呈显著负相关（P＜0.05），miR-27a、miR-378在背部皮下脂肪中的表达水平均与单不饱和脂肪酸含量呈负相关（P＞0.05）。

3 讨 论

为探明猪脂肪沉积性状相关基因或调控因子差异表达的分子遗传机理，近年来育种学家已在猪脂肪沉积的调控机理方面做了大量研究[8-10]，但这些研究主要集中在DNA和mRNA水平的编码基因，随着miRNA的发现和功能研究的深入，从转录后的miRNA水平探索猪脂肪沉积形成的分子机理成为研究热点。胴体瘦肉率是评价胴体品质的主要指标，而脂肪是影响猪经济价值和肉质风味的重要因素[11-12]。本研究中6个地方猪种属脂肪型猪种，脂肪沉积多，其胴体瘦肉率极显著低于大约克夏猪，多不饱和脂肪酸含量显著低于大约克夏猪，单不饱和脂肪酸含量除雅南猪外则均显著高于大约克夏猪。这说明地方猪种肉质优良，口感风味俱佳，是培育优质风味猪的优良素材。

miRNA在猪脂肪形成过程中起着重要的调节作用[13-14]。miR-27在脂肪细胞分化、代谢和脂肪形成中发挥着重要的调节作用。研究表明，miR-27a和miR-27b与LPL基因的表达有关，在细胞中miR-27过表达能够降低LPL基因的表达量，并抑制甘油三酯的积累以及脂肪生成；同时，miR-27a和miR-27b还可通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ、视黄醛X受体α、脂联素、脂肪酸结合蛋白4和葡萄糖转运蛋白4等脂代谢相关基因的表达[14]，加速甘油三酯水解[15]。miR-378则可以增强脂肪酸结合蛋白4、FAS和硬脂酰辅酶A脱氢酶（SCD-1）等脂肪酸代谢相关基因的表达[4-5]。本研究发现，大约克夏背部皮下脂肪中3种miRNA表达水平均显著高于6个地方猪种；6个地方猪种背部皮下脂肪中miR-27a、miR-378相对表达量均为雅南猪最高；相关性分析显示，3种miRNA相对表达量均与瘦肉率和多不饱和脂肪酸呈极显著正相关。以上说明这3种miRNA可抑制猪脂肪沉积，促进多不饱和脂肪酸生成，这与外种猪比地方猪脂肪沉积能力强、肉质易酸败的生物学特性相一致。本研究结果可为阐明猪脂肪代谢和肉品质形成的分子机理提供基础数据，并为优质风味猪育种提供新的研究思路。

表3 miR-27a、miR-27b、miR-378与胴体、肉质相关性状的相关性分析