线性离子阱飞行时间质谱仪的研制及性能表征

黄 晓，田琴琴，范荣荣，李 辉，黄 保，邹 星，朱 辉*，黄正旭,

(1.昆山禾信质谱技术有限公司，江苏 昆山 215300；2.广州禾信仪器股份有限公司，广东 广州 510632；3.暨南大学 质谱仪器与大气环境研究所，广东 广州 510632)

近十年来，随着电喷雾电离(Electrospray ionization，ESI)和基质辅助激光解吸电离(Matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)等软电离技术的日趋成熟[1-2]，生物质谱技术得到了长足发展，亦使仪器装置的竞争达到了白热化的程度。飞行时间质谱仪(Time-of-flight mass spectrometer，TOF MS) 具有灵敏度好、质量分辨率高、分析速度快、质量检测上限只受离子检测器限制等优点[3-5]，结合ESI源，还可得到较宽的质量范围，非常适合于有机聚合物、大分子及生物样品的检测[6-8]。但是，脉冲式工作方式的TOF MS结合产生连续离子流的ESI源，存在仪器占空比低及离子利用率不高的问题[9]。为解决此问题，Chernushevich等[10-11]先后开发了一种将离子囚禁后再定时释放的垂直引入式TOF分析器，其占空比接近100%，但质量范围很窄。为此，Okumura等[12]将三维(3-Dimensional，3-D)离子阱和TOF杂化联用以提高质量范围，但3-D离子阱存在空间电荷效应，离子容量较小，灵敏度低。由于LIT(Linear ion trap，LIT)在离子捕获、存储效率和质量分辨率等方面比3-D离子阱更有优势，Douglas[13]、Hashimoto[14]等先后开发出LIT与TOF的联用技术，在m/z174～1 922质量范围内仪器的占空比提高到60%以上，极大提高了TOF的灵敏度。

本研究将ESI源、LIT和TOF结合，研制了一款具有线性离子阱功能的飞行时间质谱仪—LIT-TOF MS，开发出LIT与TOF的联动脉冲技术，进一步提升了仪器的占空比，从而获得更好的灵敏度。本文详细介绍了该自制LIT-TOF MS的结构，并通过对仪器的质量分辨率、质量范围、灵敏度和多级质谱能力的考察，展示了该仪器在药品、环境、食品等领域的应用潜力。

1 仪器研制

自制的LIT-TOF MS仪器结构如图1所示，按功能分为质谱接口、离子导引射频四极杆、线性离子阱、离子光学系统及飞行时间质量分析器5个部分。分析物离子由大气压下电离源(如ESI等)产生，在电场牵引下，被送入质谱仪器的接口，经过加热不锈钢毛细管(Capillary)、管型透镜(Tube lens)、分离锥(Skimmer)，进行差分真空后进入射频四极杆(Radio frequency quadrupole，RFQ)中，再聚焦在中心轴附近进入LIT中，离子在LIT内按需要经母离子筛选、碰撞诱导解离(Collision induced dissociation，CID)等后引入直流四极杆(DC Quadrupole，DCQ)及离子光学透镜(Lens)，聚焦后进入TOF分析器进行检测。

图1 仪器结构示意图Fig.1 Schematic diagram of the instrument

LIT-TOF MS可在3种模式间自由切换：(1)TOF模式：ESI源产生的连续离子流在LIT中只进行碰撞冷却，被TOF直接检测；(2)Trap模式：结合LIT的囚禁功能，使离子源产生的连续离子流变为脉冲式离子流，提高仪器占空比；(3)LIT-TOF联用模式：通过离子阱上的宽频频率扫描对目标离子进行隔离，然后通过辅助射频信号进行裂解，再进入TOF MS检测，记录隔离母离子的碎片谱图。3种模式可通过改变控制时序、离子阱的入口和出口电势、激发频率及幅值等参数来自由转换。

1.1 真空系统

仪器采用四级差分真空系统，一级真空(大气压接口)压强100 Pa，由1台16 L/s的旋片式机械泵(SV65 BI，德国莱宝公司)来保证；二级真空(RFQ)压强0.3 Pa，三级真空(LIT)压强2×10-3Pa，四级真空(TOF)压强2×10-4Pa，分别由1台Hipace80分子泵、2台Hipace300分子泵(德国Pfeiffer公司)及1台6 L/s的旋片式机械泵(RVP-6，北京中科科仪公司)作为前级泵获得所需的差分真空。每个真空区域各设一个真空规实时监控。

1.2 线性离子阱(LIT)

LIT由一组四极杆及前后端盖电极组成，通过施加在端盖电极上的阻挡电势，在LIT轴向上形成势阱，从而将离子束缚住。四极杆上分别施加一组幅值相等、相位相差180°的射频信号，其频率为1 MHz、最大幅值为2 kVpp。其中一组电极上叠加有辅助射频信号，用于离子阱扫描过程或CID过程时，输出单频正弦信号；用于离子质量隔离时，输出数字存储傅立叶反变换波形(Stored waveform inverse Fourier transform，SWIFT)。

1.3 飞行时间质量分析器(TOF)

TOF采用垂直引入双场加速反射式飞行时间结构，由离子调制传输器、加速器、无场飞行区、反射器和离子检测器构成。推斥板与反射板距离仅550 mm，但离子的有效飞行距离达1.3 m。

图2 LIT与TOF脉冲时序图Fig.2 Pulse sequence diagram of LIT and TOF

表1 质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters

1.4 LIT与TOF联动脉冲技术

LIT与TOF联用时，离子引出方式为轴向引出，为提高离子利用率和仪器占空比，LIT端盖电极脉冲与TOF的推斥脉冲采用联动控制(如图2所示)。将离子阱内离子引出到TOF时，端盖电极上的电压由高电平变为低电平，相当于门开，离子被引出，此时同步产生一个5 VTTL信号给TOF脉冲板，经过一定的延时(t1)后，脉冲板在推斥板上产生一串脉冲串，可通过设置不同的脉冲持续时间(t2)、脉冲周期(t5)调节施加的脉冲个数。通过将LIT端盖电极脉冲与TOF的推斥脉冲联动控制，根据目标离子的质荷比大小，设置合适的脉冲延时(t1)，目标离子漂移至推斥区时，再施加推斥脉冲，可大大提高目标离子的利用率和仪器占空比。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

线性离子阱飞行时间质谱仪LIT-TOF MS(自主研发)；Sartorius万分之一天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司)；实验标准品利血平(分析标准品，≥99.5%)、L-脯氨酸(分析标准品，99%)购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；质谱标准物Ultramark1621(分析标准品)购于美国Alfa Aesar公司。

2.2 实验方法

2.2.1标准溶液的配制分别准确称取10 mg利血平、Ultramark1621和L-脯氨酸标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L的标准储备液。分别从1 000 mg/L的利血平和Ultramark1621标准储备液中移取10 μL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，配制成100 μg/L的标准溶液。从1 000 mg/L的L-脯氨酸标准储备液中分别移取1、5、10、50、100、200 μL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，配制成质量浓度分别为10、50、100、500、1 000、2 000 μg/L的L-脯氨酸溶液。

2.2.2质谱条件电喷雾电离源(ESI)，采集模式：正离子检测模式，雾化气：氮气(纯度99.999%)，样品进样流速为5 μL/min。优化后的质谱参数如表1所示。

3 结果与讨论

3.1 性能表征

3.1.1质量分辨率分别取100 μg/L的利血平标准溶液和Ultramark1621标准溶液，仪器设置为TOF模式，得到m/z609的[C33H41N2O9]+(利血平离子)和m/z1 222的[C24H19O6N3P3F36]+(Ultramark1621离子)的质量分辨率分别为13 367(图3A)和15 549(图3B)。

3.1.2质量范围分别取纯甲醇和100 μg/L的 Ultramark1621标准溶液，仪器设置为TOF模式，最小可测到m/z33的[CH3OH+H]+峰(图4A)，其信噪比大于10；最大可检测到m/z1 922的[C38H19O6N3P3F64]+峰(图4B)，其信噪比大于3。

3.1.3灵敏度分别取纯甲醇(空白)和1 μg/L的利血平标准溶液，仪器设置为Trap模式，以5 μL/min流速进样，得到仪器的灵敏度谱图如图5所示。图中可见明显的谱峰，噪音水平小于5，主峰信噪比S/N>10。

3.1.4多级质谱取100 μg/L利血平标准溶液，仪器设置为Trap模式，得到利血平的一级谱图如图6A所示。开启LIT-TOF联用模式，设置辅助射频信号为SWIFT混频模式，SWIFT频率缺口中心频率为125 kHz(RF频率1 MHz，幅值600 Vpp，场径5.22 mm)，对母离子m/z609进行捕获，隔离窗口为±3 amu时，目标离子的隔离效率≥80%(图6B)。设置CID过程中辅助射频信号为频率124.5 kHz、幅度0.35 Vpp的单频正弦信号，对母离子进行激发，产生碎片离子m/z448、397、195，碰撞诱导解离(CID)效率≥80%，得到利血平的二级谱图(图6B插图)。继续设置辅助射频信号为SWIFT混频模式，SWIFT频率缺口中心频率为113 kHz(RF频率1 MHz，幅值400 Vpp，场径5.22 mm)，对母离子m/z448进行捕获，隔离窗口为±3 amu时，目标离子的隔离效率≥80%。设置CID过程中辅助射频信号为频率112.5 kHz、幅度0.35 Vpp的正弦信号，对碎片离子m/z448进行激发，产生碎片离子m/z195、236，CID效率≥80%，得到利血平的三级谱图如图6C所示。

图6 利血平离子的一级质谱图(A)、二级质谱图(B)、三级质谱图(C)Fig.6 MS spectrum of reserpine(A)，MS/MS spectra of reserpine(B)，MS3 spectra of reserpine(C)

图7 L-脯氨酸的质谱图Fig.7 MS spectrum of L-prolineinsert：MS/MS spectrum of L-proline

3.2 氨基酸检测

氨基酸的常规检测手段包括气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[15]、液相色谱-质谱联用仪(Liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)[16]及毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)[17]，这些检测方法由于需进行繁琐而费时的预处理，难以实现对大量样品的快速检测[18]。而LIT-TOF MS结合大气压电离源可对复杂基体样品进行直接检测，无需预处理，非常适用于氨基酸的直接快速检测。因此，本研究以L-脯氨酸作为检测样品进行初步的应用分析。分别取空白(纯甲醇)，以及质量浓度分别为10、50、100、500、1 000、2 000 μg/L的L-脯氨酸标准溶液，在LIT-TOF联用模式下，记录L-脯氨酸碎片离子[M+H-CO-H2O]+(m/z70)(图7)的峰面积，以峰面积(y)对样品质量浓度(x，μg/L)进行回归分析。结果显示，L-脯氨酸在10～2 000 μg/L质量浓度范围内与峰面积呈良好线性，其线性方程为y=0.446x+16.367，r2=0.991。表明LIT-TOF MS可为代谢组学研究中实时、在线、高通量测定生物复杂样品中氨基酸的含量及其变化提供一定依据。

4 结 论

本研究设计并搭建了一款线性离子阱飞行时间质谱仪LIT-TOF MS，开发了LIT与TOF的联动脉冲技术。以电喷雾离子源对仪器的性能指标进行测试，结果表明，仪器的整体性能优异：仪器质量分辨率为13 367(m/z609)及15 549(m/z1 222)，质量检测范围为m/z33～1 922，灵敏度为1 μg/L，能够实现离子碎裂、离子储存和MS3三级质谱分析等功能。该仪器集成了线性离子阱的高容量、多级质谱能力和飞行时间质谱高速、高分辨的能力，结合大气压电离技术，可对复杂基体样品进行直接检测，无需预处理，在药品、环境、食品等领域有广阔的应用前景。