液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中16种头孢菌素类药物

张 艳，吴银良

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

头孢菌素类药物(Cephalosporins，CEPs)又名先锋霉素类药物，属β-内酰胺抗生素，兽医临床应用广泛。CEPs品种多，现已发展到第五代。头孢菌素类药物虽较青霉素类药物过敏反应低，但过量使用会导致人体内白血球降低，影响内脏功能，发生脏器损伤等，对老人、儿童，特别是胎儿的影响较大[1-2]。为保障公众健康安全，我国已对头孢氨苄、头孢喹肟和头孢噻呋3种头孢菌素类药物制定了动物性食品中最高残留限量(Maximum residue limit,MRL)(20～200 μg/kg)[3]；但对于常用的头孢拉定、头孢噻肟等药物，目前尚未制定其MRL，因此在畜禽生产中存在滥用头孢菌素类药物的现象。考虑到抗生素的耐药性问题，部分国家目前已禁止在家畜饲料中使用头孢菌素类药物[4]。因此，为保障人类用药和我国动物性食品安全，建立简单、快速的测定饲料中头孢菌素类药物的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法具有重要意义。

目前头孢菌素类药物的检测方法常使用微生物法[5]、液相色谱法[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8-16]和毛细管电泳法[17]，且主要集中于牛奶[10-11,15]和肉[9,14,17]类样品，少数方法涉及鸡蛋[16]和饲料样品[12-13]。国内尚无有关饲料中头孢菌素类药物分析方法的研究。固相萃取小柱净化是最常用的前处理手段[8,10,15]，考虑到头孢菌素类药物在中性和酸性条件下固相萃取保留较差，通常在上柱前将溶液调至pH 8.5左右[15]，从而导致已有方法工序复杂、操作繁琐、成本较高，难以满足批量样品同时分析的需要。本研究比较了提取液直接稀释与固相萃取净化方法的性能参数，建立了提取后直接稀释进样分析配合饲料中头孢菌素类药物的LC-MS/MS方法。该方法具有简单、快速、准确、灵敏的优点，为饲料中头孢菌素类药物的风险监测提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配置电喷雾离子源； IKA Vortex Genie 3漩涡振荡器(德国IKA公司)，低温高速离心机(德国Sigma公司)。

头孢菌素类药物标准品：头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢噻肟、头孢噻呋、头孢羟氨苄、头孢呋辛(德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH)，头孢乙腈、头孢匹林(德国WITEGA laboratorien Berlin-Adlershof GmbH)，头孢洛宁、头孢噻吩、头孢他定(加拿大Toronto Research Chemicals公司)，头孢克洛、头孢丙烯(中国食品药品检定研究院)，所有标准品的纯度均大于92%。甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)，HLB小柱(500 mg/6 mL，美国Waters公司)；实验用水为 Milli-Q 超纯水。

1.2 色谱-质谱条件

色谱柱：Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～1.0 min，5%B；1.0～4.5 min，5%～50%B；4.5～7.5 min，50%～70%B；7.5～7.6 min，70%～5%B，7.6～9.0，5%B；流速0.30 mL/min；进样量10 μL。

ESI源正离子模式电离；多反应监测(MRM)；毛细管电压：2.5 kV；萃取锥孔电压：25 V；RF透镜电压：0.5 V；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气流速：30 L/h；脱溶剂气流速：1 000 L/h；其它条件见表1。

表1 16种头孢菌素类药物的保留时间、母离子、子离子、锥孔电压及碰撞能量Table 1 Retention times,precursor ions，product ions，cone voltages and collision energies of 16 cephalosporins

(续表1)

No.CompoundRetention time(min)Precursor ion(m/z)Product ions(m/z)Cone voltage(V)Collision energy(eV)13Cefuroxime(头孢呋辛)5.57447.0341.9*,385.91612,1014Ceftazidime(头孢他定)4.48547.0166.7,467.9*426,1015Cefaclor(头孢克洛)5.15367.9105.7*,173.8618,1416Cefprozil(头孢丙烯)4.95390.0113.6*,207.8618,8

*quantitation ion

1.3 样品前处理

取试样5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入乙腈-水(40∶60)溶液25 mL，以300 r/min振荡提取30 min，再以5 000 r/min离心5 min后，用乙腈-水(40∶60)溶液25 mL重复提取1次，合并上清液至50 mL容量瓶中，用乙腈-水(40∶60,体积比)溶液定容。吸取0.4 mL上清液，加0.1%甲酸溶液0.6 mL，混合均匀，过0.22 μm滤膜后，待测定。

1.4 加标回收实验

对阴性猪配合饲料进行加标回收实验，样品处理同“1.3”，头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢喹肟、头孢噻吩、头孢呋辛和头孢他定7种药物的加标水平为50、500、2 500 μg/kg，其余头孢菌素类药物的加标水平为10、50、500、2 500 μg/kg。称样后加入标准溶液，涡旋混匀放置0.5 h后进行样品处理。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

已建立的头孢菌素类药物的LC-MS/MS分析方法通常采用正离子模式进行电离[8-16]。本实验用水-甲醇(95∶5，体积比)溶液分别配制1.0 mg/L的16种头孢菌素类药物溶液，利用仪器自带Intellistart软件优化质谱条件并获得定性、定量离子对，结果发现16种头孢菌素类药物在正离了模式下均能获得较好的响应，其中头孢唑林、头孢乙腈、头孢噻吩和头孢呋辛的母离子均为[M+Na]+，其余头孢菌素类药物的母离子为[M+H]+；同时发现头孢噻吩和头孢呋辛在负离子模式下也有较好的响应，但与正离子模式下的分析灵敏度差异不显著，因此本研究采用表1中的质谱条件进行实验。

文献表明，当采用Waters超高效液相色谱仪分析头孢菌素类药物时，Waters Acquity UPLC BEH C18、Waters Acquity Xselect CSH C18等色谱柱均能取得较好的保留和分离效果[7]，因此本实验采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱考察了甲酸溶液-甲醇和甲酸溶液-乙腈2种流动相体系的响应情况，发现当采用0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱时，头孢乙腈、头孢唑林等药物的响应较差，而采用0.1%甲酸-甲醇体系进行梯度洗脱时16种头孢菌素类药物的响应均较好，因此确定0.1%甲酸-甲醇体系为流动相，梯度洗脱条件见“1.2”。

2.2 前处理条件的优化

生物样品中头孢菌素类药物的常用提取剂有甲醇[13]、甲醇-水[12]和乙腈-水[8-9,16]等。因饲料样品中通常富含蛋白质和脂类物质，用甲醇或甲醇-水提取时样液较混浊，需进一步净化去除蛋白。而用乙腈提取时，因蛋白变性沉淀，提取后杂质少，且提取液澄清，因此本研究使用乙腈、乙腈-水(50∶50，体积比)、乙腈-水(40∶60，体积比)和乙腈-水(25∶75，体积比)4种提取液对猪配合饲料在500 μg/kg加标水平下进行提取，结果发现用乙腈提取时所有药物的回收率均在10%以下，采用乙腈-水(50∶50)和乙腈-水(25∶75)提取时，不能使所有头孢菌素类药物的提取回收率达到90%以上；而采用乙腈-水(40∶60)时，所有头孢菌素类药物的回收率均大于90%，因此确定以乙腈-水(40∶60)进行提取。目前用于动物性食品提取的乙腈溶液中乙腈含量均高于60%[7-8,15]，而本实验中乙腈的比例仅为40%，可能是饲料样品比动物性食品的含水量低所致。

500 μg/kg的猪配合饲料加标样品经乙腈-水(40∶60)提取后，比较了直接稀释法与固相萃取法的加标回收率、方法灵敏度、基质效应和用时，其中固相萃取法参考GB/T 22942-2008[18]，即5 mL提取液用25 mL磷酸二氢钠缓冲溶液稀释后，调至pH 8.5过柱，用乙腈洗脱吹干后以15%乙腈溶解(溶解液体积分别为1.0、12.5 mL)。结果发现，直接稀释法的回收率(88.7%～93.6%)明显高于固相萃取法(75.2%～82.1%)；当固相萃取法采用1.0 mL的15%乙腈溶解时，基质效应明显大于直接稀释法(图1)，而采用12.5 mL 15%乙腈溶解时，基质效应比直接稀释法略有改善，斜率比值(基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率的比值)在0.8～1.2范围外的药物由4种减至1种(图1)；直接稀释法的灵敏度(检出限为1.5～15 μg/kg)比固相萃取法采用1.0 mL 15%乙腈溶液溶解时(检出限为0.12～1.5 μg/kg)的灵敏度低；时间方面，直接稀释法完成6个样品的稀释仅需3 min，而固相萃取法则需约2.5 h。动物性食品中MRL限量为20～200 μg/kg，头孢菌素类药物在饲料中使用浓度通常较高[3]。综合考虑用时、基质效应和回收率，本实验最终采用直接稀释法。

图1 不同净化方式下的基质效应Fig.1 Matrix effects of different purification methods the order number of the cephalosporins is the same as that in Table 1

2.3 线性实验

在优化条件下，利用稀释后的猪配合饲料空白样品提取液配制0.1、0.5、5、20、50、200、500 μg/L的系列基质标准工作溶液(其中头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢喹肟、头孢噻吩、头孢呋辛和头孢他定为0.5、5、20、50、200、500 μg/L)进行LC-MS/MS分析，以峰面积(Y)对相应质量浓度(X，μg/L)作标准曲线，得到回归方程和相关系数(r2)。16种头孢菌素类药物在上述质量浓度范围内线性关系良好，r2均大于0.999。

2.4 方法的专属性

按照“1.4”方法同时进行空白猪配合饲料样品、加标样品和干扰样品(空白样品中添加β-内酰胺类药物青霉素G、青霉素V、氯唑西林、苯唑西林、氨苄西林、阿莫西林、双氯西林)实验，结果发现空白样品和干扰样品未出现干扰峰，表明方法的专属性较好。

2.5 回收率、精密度与检出限

按照“1.4”方法进行加标回收实验，每批次同一浓度5个平行样品，重复3次，其中第1批的结果见表2，加标样品的MRM色谱图见图2。由表2可知，16种头孢菌素类药物的加标回收率为88.4%～93.6%，相对标准偏差(RSD)为0.8%～4.7%，满足饲料中头孢菌素类药物含量的测定要求。按3倍信噪比(S/N=3)计算该方法对16种头孢菌素类药物的检出限(LOD)为1.5～15 μg/kg；按S/N=10计算得定量下限(LOQ)为5.0～50 μg/kg。我国农业部235号公告规定头孢氨苄、头孢喹肟和头孢噻呋在动物性食品中的MRL为20～200 μg/kg[3]，而本研究的分析对象为饲料，其分析要求通常低于动物性食品，且本方法检出限可达1.5～15 μg/kg，因此能满足饲料中该类药物含量的分析需要。

表2 猪配合饲料中16种头孢菌素类药物的回收率与相对标准偏差

*no recovery experiments have been carried out

2.6 方法应用

采用优化后的样品前处理方法和分析条件分别对随机采集的16个配合饲料样品进行分析，均未检出上述16种头孢菌素类药物。

3 结 论

通过提取方法和仪器条件优化，建立了同时分析配合饲料中16种头孢菌素类药物的液相色谱-串联质谱方法，样品经乙腈-水溶液提取后可直接稀释进样分析。16种药物在10～2 500 μg/kg加标范围内的平均回收率为88.4%～93.6%，RSD为0.8%～4.7%；检出限为1.5～15 μg/kg，定量下限为5.0～50 μg/kg。方法具有简单、快速、准确和灵敏的特点，能满足饲料中16种药物含量分析的需要。