高效液相色谱法测定大黄滴眼液中黄芩苷含量*

林 梦 ，蒋 斌 ，张华峰 ，王玳珠 △，吴庆瑜

（1.南京中医药大学苏州附属医院·苏州市中医医院，江苏 苏州 215000； 2.江苏省苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215000； 3.江苏省苏州市体育运动学校，江苏 苏州 215000）

大黄滴眼液由苏州市中医医院眼科自制，集中药理法、西药使用方法于一身，功效为清热解毒，主要用于治疗各种类型的结膜炎，特别是慢性结膜炎，临床研究显示，该药疗效比西药抗生素滴眼液佳。该药主要中药成分为大黄和黄芩，其中黄芩具有抗菌、抗病毒作用，其抑菌的有效成分为黄芩苷［1-2］。现行大黄滴眼液质量标准中未对黄芩苷进行测定［3］，为提高该制剂质量标准，本研究中结合 2015 年版《中国药典（四部）》［4］和文献［5-15］，采用高效液相色谱法测定其黄芩苷含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪，包括2998二极管阵列检测器，Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美国Waters公司）；Milli-Q型纯水机（美国密理博公司）；AG285型电子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）；KQ-100VDE型双频数控超声波清洗机（昆山市超声仪器公司）。

1.2 试药

大黄滴眼液（苏州市中医医院自制，批号分别为140312，140324，140331，规格为每支 8 mL）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110715-201117）；冰醋酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水 -冰醋酸（45 ∶55 ∶1）；检测波长：315 nm；流速：1.0 mL ／min；进样量：10 μL。理论板数按黄芩苷峰计应不低于2 000。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取黄芩苷对照品12 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备溶液。

供试品溶液：精密量取本品5 mL，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

阴性对照品溶液：取不含黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液，按2.1项下色谱条件进样，结果供试品溶液色谱与对照品溶液色谱在相应保留时间处均出现黄芩苷峰，且峰形良好，无杂质干扰，保留时间约为7.5min。阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取黄芩苷对照品贮备溶液10 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。取对照品溶液，分别进样 2，4，6，8，10 μL，取对照品贮备溶液分别进样10 μL和20 μL。记录峰面积，以质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得黄芩苷回归方程 Y＝23 118X-79 768，r2＝0.999 9（n＝7）。结果表明，黄芩苷溶液质量浓度在 21.787 9 ～435.758 4 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取黄芩苷对照品溶液10 μL，按拟订色谱条件连续进样6次，记录黄芩苷峰面积。结果的 RSD为0.20%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批供试品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果的RSD为0.95%（n＝6），表明方法重复性良好。

最低检出限和最低定量限确定：经检测，黄芩苷最低定量限为 0.174 μg／mL（S／N ＝10）；最低检出限为0.087 μg／mL（S ／N ＝3）。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12 h时进样 10 μL，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果的 RSD为1.23%（n＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：取同一批样品，精密量取2mL，取6份，分别精密加入黄芩苷对照品贮备液 2.0，2.5，3.0 mL。依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果（n＝9）

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定黄芩苷的色谱峰面积。结果3批（批号分别为140312，140324，140331）样品中黄芩苷的含量分别为0.24，0.22，0.25 g ／L。

3 讨论

3.1 测定波长选择

经在线全波长紫外吸收光谱扫描分析，黄芩苷在315 nm波长处有良好的紫外吸收强度。本研究中，采用315 nm作为检测波长时，黄芩苷为主要吸收峰，分离度好，峰形良好，且其他物质对测定无干扰。

3.2 流动相和柱型选择

本研究中比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸系统测定黄芩苷的差异，采用甲醇-水、乙腈-水系统测定黄芩苷内有干扰色谱峰，而甲醇-水-冰醋酸系统能去除干扰，明显改善黄芩苷色谱峰的分离。由于其他药味中的化学成分干扰黄芩苷的测定，故选择了多型号的反相硅胶色谱柱进行比较，最后采用Waters Symmetry C18柱，取得了良好的分析效果。

3.3 提取方法选择

在样品提取中，考察了甲醇、水、70%甲醇对大黄滴眼液中黄芩苷提取率的影响，结果70%甲醇的提取效率高于甲醇和水，最终采用70%甲醇提取黄芩苷。

3.4 灭菌方法选择

眼用制剂属无菌制剂［4］，大黄滴眼液中的黄芩苷具有热不稳定性［1］，试验中考察了过滤和辐照2种灭菌方法对大黄滴眼液中的黄芩苷含量的影响，结果发现，过滤灭菌法对大黄滴眼液中黄芩苷的含量无影响，而辐照灭菌后难以测出其含量。

综上所述，本研究中建立的高效液相色谱法，操作简单，分析快速，精密度高，稳定性好，空白无干扰，可为提高大黄滴眼液的质量标准提供依据。