4种大黄制剂微生物限度检查方法验证及分析*

易 伟，李 思，吴晶晶，苏 华，王曙东

（中国人民解放军南京军区南京总医院制剂科，江苏 南京 210002）

口服制剂中微生物限度的检查是药品质量控制的一项重要指标。当药品本身具有抑菌作用时，应首先消除抑菌性，以保证检验结果的有效性［1］。本研究中按2015年版《中国药典（四部）》通则1100生物检查法（以下简称“通则1100”）建立了保肾片、新保肾片、炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊4种大黄制剂相应的微生物限度检查方法，根据制剂抑菌作用强度的不同，采用了常规法、培养基稀释法和薄膜过滤法进行验证，为大黄制剂的微生物限度检查提供参考。现报道如下。

1 材料、仪器与试药

仪器：PYX-DHS-40×50型隔水式电热恒温细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；PYX-DHS.500-BS型隔水式电热恒温细菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；MJ-Ⅱ型霉菌培养箱（上海恒科有限公司）；SQ510C型立式压力蒸汽灭菌器（雅马拓科技贸易有限公司）；苏Q／WS2-175-79型电热恒温鼓风干燥箱（连云港医疗器械设备厂）；MP1100B型电子天平，MP2001型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；匀浆仪；开放式过滤器；双人操作台。

菌种：金黄色葡萄球菌 ［CMCC（B）26003第 3代］，铜绿假单胞菌 ［CMCC（B）10104第3代］，枯草芽孢杆菌 ［CMCC（B）63501 第 3 代］，大肠埃希菌 ［CMCC（B）44102 第 3 代］，白色念珠菌［CMCC（F）98001 第 3 代］，黑曲霉［CMCC（F）98003第3代］，均购自江苏省食品药品检验所。

培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（批号为151028），胰酪大豆胨液体培养基（批号为151103），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号为151022），沙氏葡萄糖液体培养基（批号为 151022），麦康凯琼脂培养基（批号为1511092），麦康凯液体培养基（批号为 1511092），均由北京三药科技开发公司生产，中国食品药品检定研究院监制，购自江苏省食品药品检验所。稀释剂为pH＝7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液（蛋白胨，规格为每瓶250 g，北京三药科技开发公司，中国食品药品检定研究院监制，批号为141023，以下简称“中性缓冲液”）。依照《中国药典》微生物限度检查项下稀释剂配制方法配制，灭菌备用。

试药：保肾片（批号分别为 170214，170308，170420），新保肾片（批号分别为 161216，170102，170213），炎黄保肾胶囊（批号分别为 160602，161101，161226），新肾炎胶囊（批号分别为 160510，170703，170908），均由我院制剂科提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10 mL胰酪大豆胨液体培养基中，将上述各培养基均置细菌培养箱（30～35℃）培养24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至10 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，置霉菌培养箱（20～25℃）培养48h；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，置霉菌培养箱（20～25℃）培养7 d，使大量孢子形成。用5 mL含0.05%聚山梨酯80的无菌中性缓冲液将孢子洗脱，并过滤孢子至无菌试管内。取上述各培养物1 mL，用中性缓冲液10倍递增稀释，对常规法（每皿1 mL）分别制成菌落数的3 000～10 000 cfu／mL的菌悬液，用培养基稀释法（每皿0.2 mL）分别制成菌落数为 15 000～50 000 cfu／mL 的菌悬液。

2.2 供试液制备

保肾片、新保肾片供试液：分别取样10 g，加中性缓冲液至100 mL，用匀浆仪研匀，制成1∶10的供试液，备用。

炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊供试液：分别取样5 g，加中性缓冲液至100 mL，置45℃水浴震荡使溶解，制成1∶20的供试液，备用。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.3.1 常规法（每皿 1 mL）

菌液组：取2.1项下菌液 0.1 mL，加至 10 mL中性缓冲液中，反复吹洗，混匀。取1 mL注入平皿中，加入20mL左右对应的培养基，每个菌液平行制备2个平皿，测定菌液中的菌落数。

试验组：取2.1项下菌液 0.1 mL，加至 10 mL供试液中，反复吹洗，混匀。取1 mL注入平皿中，加入20 mL左右对应的培养基，每个菌液平行制备2个平皿，测定菌落数。

供试品对照组：取各供试液1 mL注入平皿中，加入培养基，测定供试品的本底菌落数。

阴性对照组：取中性缓冲液1 mL，分别注入4个平皿中，每种培养基制备2个平皿，作为阴性对照。

2.3.2 培养基稀释法（每皿 0.2 mL）

方法同常规法。仅注入平皿液体量减为0.2 mL。

2.3.3 薄膜过滤法

试验组：取供试液1 mL加至适量的稀释液中，混匀，过滤，用0.1%蛋白胨冲洗液300 mL分3次冲洗滤膜，在最后1次冲洗液中加入菌落数不大于100 cfu的试验菌株，取出滤膜，滤膜菌面朝上贴于琼脂培养基表面培养，测定菌落数。

菌液组：取1 mL中性缓冲液代替供试品，按试验组操作加入试验菌液进行微生物回收试验。所用培养基及培养条件与试验组一致。

供试品对照组：仅不加试验菌，其他操作同试验组。

阴性对照组：取1 mL中性缓冲液代替供试品，不加试验菌，其他操作同试验组。

2.4 样品中大黄酸、大黄素、大黄酚含量测定

各试药中大黄酸、大黄素、大黄酚含量均采用高效液相色谱（HPLC）法测定。测定方法分别来自王曙东等［2］对保肾片的质量标准研究，乔立业等［3］对新保肾片中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量测定，钱文慧等［4］对炎黄保肾胶囊的质量控制研究，王曙东等［5］对新肾炎胶囊中蒽醌类化合物的含量测定。

2.5 验证结果

依照下列公式计算5种菌的回收率：试验菌回收率＝［（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）／菌液组平均菌落数］×100%。结果见表1至表3。

由表1可见，采用常规法测定时4药对金黄色葡萄球菌的回收率均低于50%，且炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊对枯草芽孢杆菌的回收率也低于50%，不符合通则1100的要求（50% ～200%）。故需采用培养基稀释法对需氧菌检查计数方法重新验证；而用常规法测定时，4药对白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合药典要求。

由表2可见，采用培养基稀释法对保肾片、新保肾片进行需氧菌、霉菌及酵母菌回收率的测定时，5种菌种的回收率均符合药典要求。而采用培养基稀释法时，炎黄保肾胶囊对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率低于50%，新肾炎胶囊对金黄色葡萄球菌的回收率低于50%，说明抑菌性较强，故考虑用薄膜过滤法进行炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊需氧菌回收率的测定。培养基稀释法用于炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊霉菌及酵母菌回收率的测定相比常规法较优。

由表3可见，采用薄膜过滤法对炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊进行需氧菌回收率的测定时，5种菌种的回收率均符合药典要求。

2.6 样品主成分含量与验证菌回收率的关系

对3批次样品的大黄酸、大黄素、大黄酚含量总和与金黄色葡萄球回收率的相关性进行了分析，结果见表4。可见，三者含量总和与金黄色葡萄球菌的回收率呈负相关。本研究中分别采用常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法进行回收率试验，结果发现，用培养基稀释法（每皿加入培养基约20 mL）可消除保肾片和新保肾片的抑菌作用，即含量总和的质量浓度稀释至约20 μg／mL时可消除其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用；而对于新肾炎胶囊和炎黄保肾胶囊，若采用培养基稀释法，含量总和的质量浓度约60 μg／mL，此时已不能消除其抑菌性，只有通过薄膜过滤法消除其对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

表1 常规法测定4种大黄制剂对各试验菌株的回收率（%）

表2 培养基稀释法测定4种大黄制剂对各试验菌株的回收率（%）

表3 薄膜过滤法测定2种大黄制剂对5个需氧菌菌株的回收率（%）

2.7 控制菌（大肠埃希菌）检查方法的验证

2.7.1 常规法

试验组：取供试液10 mL（保肾片、新保肾片）或20 mL（炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊）及菌落数不大于100 cfu的大肠埃希菌悬液1 mL，加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，置细菌培养箱（30～35℃）培养18～24 h，取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，置细菌培养箱（42～44℃）培养24～48 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置细菌培养箱（30～35℃）培养18～72 h。

阳性对照组：用中性缓冲液代替供试液，按试验组方法操作加入试验菌液，所用培养基及培养条件与试验组一致。

阴性对照组：用中性缓冲液代替供试液，不加试验菌，其他操作同试验组。结果见表5。可见，保肾片、新保肾片和炎黄保肾胶囊的控制菌（大肠埃希菌）能正常检出，阴性对照未检出，符合通则1100要求，所以常规法可用于保肾片、新保肾片和炎黄保肾胶囊控制菌（大肠埃希菌）的检查。而新肾炎胶囊对大肠埃希菌具有一定的抑菌作用，需作进一步验证。

2.7.2 培养基稀释法

试验组：取供试液20 mL（新肾炎胶囊）及菌落数不大于100 cfu的大肠埃希菌悬液1 mL，加入200 mL胰酪大豆胨液体培养基中，置细菌培养箱（30～35℃）培养18～24 h，取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，置细菌培养箱（42～44℃）培养24～48 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置细菌培养箱（30～35℃）培养18～72 h。

表4 样品中大黄酸、大黄素、大黄酚含量总和与金黄色葡萄球菌回收率的关系

阳性对照组：用中性缓冲液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液，所用培养基及培养条件与试验组一致。

阴性对照组：用中性缓冲液代替供试液，不加试验菌，其他操作同试验组。结果见表6。可见，新肾炎胶囊的控制菌（大肠埃希菌）能正常检出，阴性对照未检出，符合通则1100要求，故培养基稀释法可用于新肾炎胶囊的控制菌（大肠埃希菌）的检查。

本研究中按通则1100要求，建立了4种大黄制剂的微生物限度检查法并进行了验证。保肾片和新保肾片有一定程度的抑菌作用，但可通过稀释法消除；炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊的抑菌作用强，需采用薄膜过滤法才能消除。结果见表7。

3 讨论

保肾片、新保肾片、炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊均为大黄制剂，大黄为蓼科植物掌叶大黄 RheumpalmatumL.、唐古特大黄 Rheum tanguticum Mzxim.ex Balf.和药用大黄 Rheum officinale Baill.的干燥根茎［6］，主要功效有泻下通便、清热解毒、活血化瘀等［7］。大黄的抗菌作用较强，抗菌谱较广，对革兰阳性菌抑制作用较强［8-9］。大黄的有效成分蒽醌类对葡萄球菌、链球菌有显著抗菌活性［10］，同时对幽门螺杆菌［10］、大肠埃希菌［10］、肺炎克雷伯菌［11］、沙眼衣原体［12］等均有抑制作用。

本研究结果显示，大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚的含量与金黄色葡萄球菌回收率之间呈负相关，再次验证了大黄蒽醌类成分的抑菌作用。当大黄酸、大黄素、大黄酚含量总和的质量浓度稀释至20 μg／mL时可用培养基稀释法消除其对金黄色葡萄球菌的抑制作用；而当质量浓度达到60 μg／mL时，培养基稀释法已不适用，只有通过薄膜过滤法才能消除其对金黄色葡萄球菌的抑制作用。这为其他大黄制剂的微生物限度检查方法提供了参考。

表5 大肠埃希菌验证结果（常规法）

表6 大肠埃希菌验证结果（培养基稀释法）

表7 4种大黄制剂微生物限度检查方法

本研究中，炎黄保肾胶囊和新肾炎胶囊为贵重药品，故取样量改为5 g，制备成1∶20的供试液。由于这两种药品的需氧菌计数采用薄膜过滤法，按照药典要求应取相当于1 g样品的供试液（即20 mL）进行薄膜过滤，但因中药制剂的特殊性，供试液在直接进行薄膜过滤时会堵塞滤膜，过滤很慢，甚至会无法过滤。即使勉强成功，过滤后滤膜上也会铺满厚厚的一层中药残渣，无法进行菌落计数，直接影响微生物限度检验方法的验证。故本研究中将取样量改为相当于0.05 g样品的供试液（即1 mL）进行试验，过滤效果较理想，菌落计数也能顺利进行。取样量减少虽能提高实际操作的可行性，但影响了计量的准确性。对于抑菌作用较强的样品，2015版《中国药典》只给出薄膜过滤法。当然也有离心沉淀法［13］或采用无菌滤纸、纱布、脱脂棉进行预处理［14］等非标准处理方法，这些方法存在准确度、重复性差，影响因素多，难以标准化等问题。对于具有抗菌活性的中药固体制剂微生物限度检查计数方法的研究，还需进一步探索。