响应面法优化凤丹内生真菌发酵工艺探究

张培良，许凤清，王国凯，王刚，马宗慧，刘海涛，韩婧，吴娟，吴培云

(安徽中医药大学药学院现代中药安徽省工程技术研究中心，安徽，合肥 230012)

丹皮始载于《神农本草经》[1]，作为安徽省四大道地药材之一，其道地产区主要分布于安徽铜陵、南陵等地。《中药大辞典》明文记载：“安徽省铜陵凤凰山所产丹皮质量最佳”，故道地产区出产的丹皮又称为凤丹皮，其原植物又称为凤丹(PaeoniaostiiT. Hong et J.X.Zhang)。丹皮具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降血糖、抗凝血、抗心律失常、抗高血压、增强免疫功能、抗脑缺血再灌注性损伤、镇静、保肝[2-14]等作用。

近年来植物内生真菌已成为国内外研究的热点领域，且对凤丹内生真菌的研究较少[15]。鉴于内生真菌与宿主植物之间特殊的生物学关系，且内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性成分，开展对植物中优势内生真菌的研究极具意义。前期的研究确定凤丹根皮中内生真菌优势种群为Fusarium[16]。本研究2017年8—11月采用响应面分析法对凤丹一株优势内生真菌Fusariumoxysporum的发酵条件进行优化，为其进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器Fusariumoxysporum菌株分离于新鲜的凤丹根皮，并交由上海生工生物工程有限公司进行分子鉴定，经过基因测序对比后鉴定为Fusariumoxysporum(GenBank:KT271765.1)，保存于安徽中医药大学天然药化教研室。

十万分之一电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司)；SPT-P250C智能生化培养箱(合肥华德利科学器材有限公司)；QHZ-98A型全温振荡培养箱(常州普天仪器制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1菌丝体的制备 将保存于斜面试管中的真菌F.oxysporum转接于活化培养基中，28 ℃恒温培养5 d，沿菌落边缘用打孔器打取6 mm菌片，备用。称取一定量的马铃薯葡萄糖肉汤培养基粉末，加一定比例的水混合均匀，倒入250 mL锥形瓶中，每个锥形瓶中100 mL液体培养基，然后不同的锥形瓶中再分别加入不同含量的蔗糖、酵母浸出膏、KH2PO3、K2HPO3，灭菌20 min，待冷却后，将上述打孔的菌片用镊子挑取2～3片放入液体培养基中，平板摇床180 r·min-1，28 ℃培养发酵7 d后，抽滤，得到菌丝体。

1.2.2菌丝体生物量的测定 菌体生长过程中发生代谢，产生次生代谢产物，菌体的生长可促进次生代谢产物含量的增加。将培养7 d的发酵培养基抽滤，分离出菌丝体，于50 ℃真空干燥箱中烘干至恒重，记录其重量。

1.2.3响应面分析法实验设计 (1)单因素实验设计：分别以蔗糖、酵母浸出膏、KH2PO3、K2HPO3加入量为考察指标进行单因素实验设计。(2)Box-Behnken 实验设计：以单因素实验及相关参考文献为依据来设定Box-Behnken实验设计中各因素的水平，以菌丝体生物量为响应值，对影响菌丝体生物量的4个因素进行优化，同时，根据单因素实验得出响应面中心水平(0)本应为蔗糖(30 g·L-1)、酵母浸出膏(4 g·L-1)、KH2PO3(1 g·L-1)、K2HPO3(1 g·L-1)，但此时发现若按照此中心水平作响应面设计，则“蔗糖”因素的“1”水平为空，“KH2PO3”和“K2HPO3”两个因素的“-1”水平为空，因此，为了完成完整的响应面设计，从实际角度出发，最终RSM实验设计因子水平见表1。并使用Design-Expert 8.05b对数据进行处理分析。

2 结果

2.1单因素实验实验结果见图1，由结果可知，综合考虑，四个因素的最优值分别确定为30、4、1、1 g·L-1。

2.2Box-Behnken实验设计

2.2.1实验结果和分析 采用RSM实验设计对菌株的发酵条件进行优化，试验因素包括蔗糖、酵母浸出膏、KH2PO3、K2HPO34个因素，并以单因素实验结果为中心水平，进行四因素三水平的响应面优化实验，确定最佳发酵条件。使用Design expert 8.05b统计软件对实验所得数据进行多元回归拟合，得到菌丝体生物量对A、B、C、D四因素的二次多项式回归方程：

图1 4种因素对菌丝体生物量影响的趋势图

菌丝体生物量=1.54+0.097A+0.003 746B-0.049C-0.040D-0.056AB+0.021AC+0.028AD-0.022BC-0.020BD-0.002 152CD-0.25A2-0.037B2-0.000 998 8C2+0.016D2

2.2.2响应面图与等高线图分析 图2A说明蔗糖含量和酵母浸膏含量之间的交互作用显著；当蔗糖含量较小，菌丝体生物量随酵母浸膏含量的增大表现为上升，当蔗糖含量达到一定值，菌丝体生物量随着酵母浸膏含量的增大表现为先上升后下降；当酵母浸膏含量不变，菌丝体生物量随着蔗糖含量的增大表现为先上升后下降。图2B说明蔗糖含量和KH2PO3含量之间的交互作用不显著；当蔗糖含量不变，菌丝体生物量随着KH2PO3含量的增大而下降；当KH2PO3含量不变，菌丝体生物量随着蔗糖含量的增大表现为先上升后下降。图2C说明蔗糖含量和K2HPO3含量之间交互作用显著；K2HPO3含量较小时，菌丝体生物量随着蔗糖含量的增大变现为先上升后下降；K2HPO3含量一定时，菌丝体生物量随着蔗糖的增大表现为上升趋势，当蔗糖含量达到一定时，菌丝体生物量随着蔗糖含量的增大趋于平缓。图2D说明酵母浸膏含量和KH2PO3含量之间交互作用不显著；酵母浸膏含量一定时，菌丝体生物量随着KH2PO3含量的增大而上升；KH2PO3含量一定时，菌丝体生物量随着酵母浸膏含量的增加趋于平缓。图2E说明酵母浸膏含量和K2HPO3含量之间交互作用显著；酵母浸膏含量一定时，菌丝体生物量随着K2HPO3含量的增大而下降；K2HPO3含量一定时，菌丝体生物量随着酵母浸膏含量的增大表现为先上升后下降。图2F说明KH2PO3含量和K2HPO3含量之间交互作用不显著；KH2PO3含量一定时，菌丝体生物量随着K2HPO3含量的增大而下降；K2HPO3含量一定时，菌丝体生物量随着KH2PO3含量的增大而下降。

表2 响应面实验设计结果

表3 回归模型方差分析

图2 各交互作用对菌丝体生物量影响的响应曲面

2.2.3验证性试验 使用Design Expert 8.05b 对回归方程进行求解，得出最优发酵工艺为：蔗糖含量20.31 g·L-1，酵母浸膏含量5.17 g·L-1，KH2PO3含量1.00 g·L-1，K2HPO3含量1.00 g·L-1，菌丝体生物量预测值为1.660 79 g。考虑实际情况，确定最优发酵工艺为：蔗糖含量20 g·L-1，酵母浸膏含量5 g·L-1，KH2PO3含量1.00 g·L-1，K2HPO3含量1.00 g·L-1。

按照上述工艺，平行发酵3瓶发酵液，测定实际平均菌丝体生物量为1.647 g，与预测值之间偏差较小，表明此回归模型能与实际情况较好拟合。

3 讨论

微生物的发酵是一个非结构化、曲线的复杂过程，在发酵工业中，发酵培养基的优化对发酵水平的提高起着举足轻重的作用[17]。响应面法试验设计，克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，并能减少试验次数，分析几种因素间的交互作用，以达到较全面地反映各因素水平的效果[18-20]。为了获得最佳的发酵条件本实验采用响应面法，将因素与结果的关系进行多项式拟合，优选出最佳促菌丝体生物量的发酵工艺。首先采用单因素试验确定因素水平，进一步应用响应面分析法考察因素对菌丝体生物量的影响，采用二次回归设计菌丝体生物量回归模型，验证试验表明了该模型的可靠性。