胃泌素及其受体拮抗剂对人胃癌细胞株MKN45中骨桥蛋白表达的影响

苏 薇 吴会超 (遵义医学院附属医院消化内科，贵州 遵义 563003)

胃癌发病率、死亡率呈逐年上升趋势。胃泌素是胃肠道细胞分泌的胃肠激素，研究证实胃泌素在胃癌发生发展过程中扮演重要角色〔1〕。目前关于胃泌素的作用机制尚未阐明，基因调控、家族途径等为其主要作用途径，可抑制肿瘤细胞凋亡，刺激癌细胞增殖分化。骨桥蛋白(OPN)为磷酸化糖蛋白，其与致癌潜能相关，可能参与肿瘤转移过程，如促进细胞的浸润、黏附、抑制凋亡及促进血管的形成等〔2，3〕。本文分析胃泌素及其受体拮抗剂对人胃癌细胞株MKN-45中OPN表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胃癌细胞MKN45由上海慧颖生物科技有限公司提供;丙谷胺购自江苏亚邦爱普森药业有限公司;噻唑蓝(MTT)购自上海信裕生物技术有限公司;胰蛋白酶购自上海雅心生物技术有限公司;胃泌素与OPN试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司;RPMI1640培养基购自上海信帆生物科技有限公司;新生小牛血清购自北京诺亚杰生物科技有限公司;放射免疫检测仪购自瑞莱生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养温度＜37℃，在 RP-MI1640培养基中加入10%小牛血清，进行人胃癌细胞MKN45的培养，3 d传代1次，利于细胞贴壁良好生长。取细胞贴壁后72 h细胞，通过0.25%胰蛋白酶处理，制成5×107个/L的细胞悬液。

1.2.2 人胃癌细胞MKN45增殖检测 MKN45胃癌细胞经0.125%胰蛋白酶处理，在RPMI1640培养基稀释后，制成5×107个/L的细胞悬液。接种环境温度＜37℃，接种于96孔板，培养箱条件为:5%二氧化碳、37℃恒温培养。实验分为 3组，胃泌素组:胃泌素10－6mol/L;联合组:胃泌素(10－6mol/L)+丙谷胺(10－2mol/L);对照组:培养液中不添加丙谷胺。培养完成后，MTT法检测人胃癌细胞MKN45增殖情况。用二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜后在490 nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。每孔加MTT溶液〔5 mg/ml用磷酸盐缓冲液(PBS)配〕20 μl继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。于酶标仪上测定光密度值(OD值)，持续3次。促细胞增殖率(PR)=(OD实验组值－OD对照组值)/OD实验组值×100%，PR值为正，表明药物对细胞增殖具有促进作用;PR值为负，表明药物对细胞增殖具有抑制作用;PR为0，表明对细胞增殖无明显影响。

1.2.3 OPN蛋白检测 于24孔板上，加入细胞数量为5×107个/L的细胞悬液，细胞贴壁后分组并加药。12、24、36 h加入抑肽酶，每孔1 500 U，收集培养上清液，采用1∶10细胞裂解液裂解胃癌细胞，与培养上清液3 000 r/min离心15 min，获得上清液，保存在－80℃下待测，最后严格按照放射免试剂盒操作要求，收集上清液中OPN含量，通过免疫组织化学法检测胃癌细胞株MKN45中OPN蛋白的表达及胃泌素和丙谷胺对其表达的影响。其次，通过实时荧光定量PCR法(RTPCR)检测胃癌细胞株MKN45中OPN蛋白的表达及胃泌素和丙谷胺对其表达的影响，首先提取细胞总RNA，测定RNA的浓度;其次，进行逆转录反应，再次，进行琼脂糖电泳以检测扩增产物的均一性。将配好的3%琼脂糖电泳液灌注制胶板凝固后，上样。低压电泳仪100 V，55 mA约60 min跑胶。紫外分析仪上观察结果。采用BIO-RAD软件计算出目的基因与内参的比值，OPN mRNA表达量以OPN与内参的比值表示。

1.3 统计学分析 应用SPSS22.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结果

2.1 各组人胃癌细胞MKN45增殖情况 胃泌素组人胃癌细胞MKN45增殖OD值明显高于对照组、联合组，随着培养时间的延长，OD值明显升高。联合组中丙谷胺对人胃癌细胞MKN45增殖具有抑制作用，随着培养时间的延长，抑制作用明显增加。见表1，图1。

表1 各组人胃癌细胞MKN45增殖情况()

表1 各组人胃癌细胞MKN45增殖情况()

与胃泌素组比较:1)P＜0.05

组别 24 h 48 h OD值 PR(%)OD值 PR(%)联合组 0.54±0.051) － 0.77±0.061) －胃泌素组 0.61±0.04 +11.48 0.96±0.05 +19.79对照组 0.56±0.021) －8.93 0.79±0.081) －21.52

图1 各组胃癌细胞增殖情况(SP，×400)

2.2 各组OPN表达情况 OPN出现在人胃癌细胞MKN45培养液中，培养时间越长，OPN表达明显增高，胃泌素组OPN水平明显高于对照组和联合组，联合组明显低于对照组(P＜0.05)。见表2，图2。

表2 各组OPN水平比较()

表2 各组OPN水平比较()

与对照组比较:1)P＜0.05;与胃泌素组比较:2)P＜0.05

组别 12 h 24 h 36 h联合组 0.67±0.231)2) 0.78±0.241)2) 0.91±0.121)2)胃泌素组 0.97±0.181) 1.25±0.171) 1.67±0.261)对照组 0.71±0.12 0.98±0.11 1.19±0.20

图2 OPN、β-actin PCR的扩增产物琼脂糖凝胶电泳

3 讨论

胃癌是消化内科常见恶性肿瘤，其发病率、死亡率相对较高。胃癌发生原因复杂，与饮食、环境、基因、细菌感染等因素有关，早期症状不明显，就诊时已发展到中晚期。流行病学调查显示，胃癌患者治疗后复发率、远处转移率较高，累及周围脏器，导致多脏器衰竭，增加死亡风险〔4～6〕。在胃癌发生发展转移过程中，细胞因子、信号通路等参与其中。随着临床对胃癌发病机制研究不断深入，发现人胃癌细胞MKN45增殖、OPN、胃泌素在胃癌发生、发展、转移过程中占据重要地位。多数研究表明，胃泌素的促癌作用临床已证实〔7～9〕。胃泌素由胃肠道细胞分泌，其作用机制为刺激癌细胞增殖。胃泌素主要通过基因、家族等途径作用，但具体作用机制尚不明确。有研究表明，胃泌素 10－6～10－9mol/L时，具有促进MKN45细胞增殖的作用，与丙谷胺联合时，该促进作用被阻断，提示胃泌素经受体介导刺激体外培养胃癌增殖〔10，11〕。早期有文献报道，胃泌素可促进十二指肠旁黏膜表皮生长因子(EGF)分泌，表明胃泌素通过EGF刺激胃黏膜增殖〔12〕。

OPN是一种磷酸化糖蛋白，具有非胶原性和分泌性〔13〕。OPN在不同动物各种组织中均有表达，正常情况下OPN几乎不表达或表达甚微，但在一些诱导因素下大量表达，可促进肿瘤恶化，可作为肿瘤转移的标志物。有研究表明，检测胃癌组织中OPN表达，其表达率高达100%，72%以上胃癌组织或淋巴转移灶中OPN呈高表达状态，提示OPN蛋白和胃癌发生发展有关。OPN主要参与恶性肿瘤细胞侵袭转移作用，可能机制为〔14〕:(1)通过受体整合素 α、β5发挥作用;(2)与肝细胞生长因子发挥协同作用;(3)与表面CD44结合发挥作用;(4)与血管内皮生长因子发挥协同作用;(5)通过自分泌及旁分泌发挥途径;(6)抑制NO、O2、OH－等产生促进转移细胞生存。有研究表明〔15〕，OPN蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，推测参与了乳腺癌钙化过程。有研究表明，胃泌素可促进OPN表达，并促进人胃癌细胞MKN45增殖〔16〕。

本研究结果提示胃泌素可促进胃癌细胞MKN45增殖和OPN表达，且丙谷胺起到了拮抗作用。胃癌细胞MKN45产生过程中，分泌出胃泌素，采用丙谷胺可抑制胃泌素的分泌，一旦分泌胃泌素，胃泌素受体又在细胞表面表达，可见丙谷胺可抑制胃泌素的分泌。有文献报道〔17〕，17肽胃泌素在1～1 000 nmol/L时可促进MKN45细胞增殖，联合丙谷胺时，阻断了这种促进作用。丙谷胺是临床治疗消化性溃疡的常见药物，具有抗胃泌素的作用，有利于控制胃酸，抑制胃蛋白酶分泌，促进胃黏膜愈合。胃泌素作用于癌细胞的途径广泛，如神经内分泌系统、自分泌等，促进肿瘤细胞增殖，故及时阻断胃泌素对肿瘤细胞的刺激十分重要。在胃癌治疗过程中，丙谷胺治疗效果虽无法与放疗、化疗比拟，但其可抑制癌细胞生长、增殖、分化，为胃癌治疗指明新的方向〔18〕。

综上，胃癌细胞MKN45中存在OPN表达，胃泌素可促进胃癌细胞MKN45增殖、OPN表达，联合胃泌素受体拮抗剂后，可抑制肿瘤细胞增殖和OPN表达。