农作物种子检测中常用电泳方法的比较分析

郑戈文

（山西省农业种子总站，太原 030006）

种子是农业生产的基本资料，种子质量的优劣关系到国计民生，种子质量检测是把好种子质量关的重要手段。随着检测技术的不断发展，电泳技术在种子质量检测中发挥着越来越大的作用。电泳是指在电场作用下，带电颗粒向与其电性相反电极移动的现象。电泳技术是利用带电颗粒在电场作用下移动速度不同而实现分离的技术。在农作物种子质量检测中常会用到4种不同的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳、小板聚丙烯酰胺凝胶电泳、大板聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。不同的电泳方法适合不同的检测项目，各方法对实验仪器、检测技术水平、实验室条件和操作人员的要求也不同。

1 四种不同的电泳方法

1.1 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分子检测中常用的检测方法，不同浓度的琼脂糖凝胶（0.3%～1.5%）可以将200bp～50kb的DNA片段分离。当用溴化乙啶（EB，荧光嵌入染料）染色，通过凝胶成像系统，能观察到发出荧光的DNA条带，确定DNA片段在凝胶中的位置及质量，或与参照DNA比较，判定被检基因的有无。琼脂糖凝胶电泳可以检出1～10ng的DNA的存在[1]。通常实验室多用电泳仪和水平槽装置进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2 小板聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的一种电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）聚合成三维网状结构的凝胶。由于电荷效应和分子筛效应，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将分子大小相同而带不同数量电荷或者带相同数量电荷而分子大小不同的蛋白质、酶或者DNA片段分离开[2]。小板聚丙烯酰胺凝胶通常用电泳仪和小板电泳槽进行电泳。

1.3 大板聚丙烯酰胺凝胶电泳大板聚丙烯酰胺凝胶电泳原理同小板聚丙烯酰胺凝胶电泳，只是单体和交联剂的比例不同，形成大小不同的立体网状结构，胶更薄、移动距离长，能将小片段DNA（5～500bp）分离开，甚至相差2～5bp的DNA片段也能区分开。根据Marker或者参照样品DNA谱带的位置，可以估测出被检样品DNA片段的大小。大板聚丙烯酰胺凝胶电泳需要高压电泳仪和大板垂直电泳槽进行电泳。

1.4 毛细管荧光电泳毛细管荧光电泳是将胶灌在一种空芯的微细毛细管中，利用电泳和电渗流的电动力学原理，把PCR产物高效分离，利用荧光检测到产物信号，通过软件分析系统转化成峰值图导出结果的电泳技术。毛细管电泳检测方法可以将相差1bp的DNA片段分离开，通过不同的峰值图展示出来，经过参照样品和基准物质的矫正，获得相对精确的数据。在引物上标记不同的荧光信号，可以将若干组不同的PCR产物放在同一个反应孔中电泳，根据荧光信号颜色的不同和PCR产物大小的不同，分析出一个样品在不同位点的特性值[3]。毛细管荧光电泳通常在基因分析仪上进行。

2 不同电泳方法适合不同的检测项目

琼脂糖凝胶电泳在农作物种子质量检测中多用于转基因检测和DNA质量检测。在转基因检测中通过分析样品中目标DNA片段的有无与阳性对照基因比较，确定检测样品是阳性还是阴性；在分子检测中用于检测DNA的质量，观察DNA谱带的位置、整齐度和亮度来判断DNA质量的好坏。图1是一个棉花种子样品CaMV35S启动子基因的检测结果图。

图1 棉花种子CaMV35S基因检测结果

棉花种子样品1、2、3检测出CaMV35S基因，与阳性参照结果相同，其余样品均未检出该基因，试验中阳性参照样品和Marker条带清晰，阴性参照和空白对照样品均无条带，试验结果可靠。

小板聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于种子样品的纯度检测。在电泳图谱中观察分析各个泳道电泳谱带的差异，判定样品的纯度，或根据参照样品的信息估测DNA片段的大小。图2是一个玉米种子样品盐溶蛋白电泳的结果图，该图显示，此样品种子一致性较好，无异品种。

图2 玉米种子样品盐溶蛋白电泳检测

大板聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于种子样品SSR分子标记真实性检测和一致性检测。根据不同品种在各个位点的典型特异谱带，进行样品之间比较或者与DNA指纹数据库比对，判断分析种子样品的一致性和真实性。图3是一个玉米种子样品SSR分子标记方法检测引物bnlg2291k4大板聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图，该图显示，这个位点出现4种不同的特异型谱带，将20个不同的玉米杂交种分成4种不同的类型。

图3 玉米种子样品大板聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

毛细管电泳荧光检测方法主要用于农作物种子的真实性检测和一致性检测。分析软件导出的峰值图，进行合并与整理，比对指纹数据库的指纹，判定被检种子样品的身份信息。图4是20份玉米种子样品SSR分子标记引物bnlg1671y17毛细管电泳荧光检测结果图，在这个位点出现5种不同大小的特异峰，把20个不同的玉米品种分成5种不同的类型。

图4 20份玉米种子样品毛细管电泳检测

3 不同电泳方法的优缺点比较

琼脂糖凝胶电泳检测可以分离的DNA片段范围较广，且能较好地分离长度相差较大的DNA片段，操作简单，对实验室条件和操作技术人员的要求低；但是该方法需要用到EB，即一种高致癌性的强诱变剂，对操作人员和环境的污染较严重，虽然可以用EB替代物（GoldView、GelRed和 GelGreen、SYBR GreenⅠ），但易受到替代物的染色效果和稳定性的影响；另外这种方法的精确度较低，要区分大小相近的DNA片段比较困难。

小板聚丙烯酰胺凝胶电泳检测操作过程中灌胶、点样、电泳、染色等程序操作相对简单，对实验室条件、仪器设备和技术人员要求不高，但是该方法的检测分辨率较低，不能清晰地区分大小相近的DNA片段。

大板聚丙烯酰胺凝胶电泳检测精确度比小板聚丙烯酰胺凝胶电泳高，成本相对较低，但凝胶制备与电泳、染色等操作程序比较费时费力，对操作人员技术要求较高，仍无法读出谱带的精确数据，只能与参照样品比较，估测它的大小，实验室间结果的比对误差较大。

毛细管电泳荧光检测方法结果精确度高，操作简单，通量高，省时省力，但是仪器购置、维护、荧光引物、耗材等试验成本较高；并要求仪器处于适合的温度条件下，供给稳定的电源，实验室有一定的洁净度以及有经验的技术人员，以保证仪器的正常运行，确保检测数据的结果准确。

4 小结

在种子质量检测中，不同的检测项目选择不同的电泳方法。琼脂糖凝胶电泳是一种理想的检测被检基因有无和检测DNA质量的方法；小板聚丙烯酰胺凝胶电泳能区分亲缘关系较远的品种，但由于近年来品种间亲缘关系越来越近，该方法的应用率也在逐年降低；大板聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前种子样品纯度检测和真实性检测中较常用的检测方法，成本相对较低；毛细管电泳荧光检测是种子检测中精确度较高的一种技术，但检测成本较高，推荐有一定经济实力的实验室使用。随着检测技术的发展，试验成本的降低，毛细管电泳荧光检测方法是一种自动化程度较高、试验结果准确可靠、人们较信赖的检测方法。