辣椒碱通过激活结肠癌细胞NLRP3炎性小体进而促进结肠癌转移的分子机制研究

张奇瑜，鄢骑兵

1.成都医学院 生物科学与技术学院(成都610500)；2.金堂县第一人民医院 检验科 (金堂 610400)

结肠癌(colorectal cancer，CRC)是我国常见的恶性肿瘤[1]。40%～50%的CRC患者会发生肿瘤转移，其5年期生存率低于10%[2]。长期炎性环境是CRC发生的一个重要病因。传统的化疗和放疗已不能有效地治疗癌症，而且副作用较大。目前，临床研究[3-5]表明，天然化合物能有效治疗癌症。辣椒碱是辣椒中的主要活性成分[6]，长期食用易导致肠炎，适量浓度的辣椒碱能促进一系列炎症因子的高表达，具有抗凋亡和促进血管生成等重要作用。本课题组前期研究[7]结果证明，低浓度辣椒碱能促进CRC细胞转移。有研究[8]报道，炎症是癌症转移的重要驱动力。本课题拟从NLRP3炎性小体是否参与辣椒碱促进CRC转移，明确炎性相关通路在辣椒碱诱发CRC转移的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 人CRC细胞 SW480、HCT116 (中国科学院细胞库)。

1.1.2 试剂 辣椒碱 (纯度>99%)(美国sigma公司)，酶联免疫检测试剂盒( 武汉华美生物工程有限公司)，NAC(美国sigma公司)，MCC950(美国MCE公司)，NLRP3、E-cadherin、Vimentin、β-actin单克隆抗体、兔二抗、鼠二抗、羊二抗均购自cell signaling technology公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SW480 和 HCT116 细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基(含105U/L青霉素，100 mg/L 链霉素)中，于37 °C，5% CO2培养箱中培养。采用 100 μM 辣椒碱处理CRC SW480细胞和 12.5 μM 辣椒碱处理 HCT116 细胞 48 h。使用NLRP3的特异性抑制剂 1 μM MCC950， ROS抑制剂 1 M N-乙酰半胱氨酸( NAC)分别与辣椒碱共同处理结肠癌细胞 48 h。

1.2.2 酶联免疫 参考试剂盒方法，将细胞培养上清取100 uL加入已包被好的ELISA板中，37 ℃孵育2 h，用洗涤缓冲液洗板3次， 30 s/次。再加入生物素化的一抗，37 ℃孵育1 h，洗板3次，30 s/次。再加入HRP标记的的二抗，37 ℃孵育0.5 h，洗板5次，30 s/次。最后加入TMB显色剂，显色15～30 min，加入终止液终止，于酶标仪中450 nm波长下读数。

1.2.3 细胞迁移分析(Transwell)法 将2.5×104个细胞接种于Transwell小室中，小室内加入辣椒碱或与MCC950的混合液，处理上室中的CRC细胞48 h后，结晶紫染色测定迁移的细胞个数。

1.2.4 免疫印迹 参考文献[9]方法，收集经药物处理后的细胞，按1×106细胞浓度加入100 μL细胞裂解液，震荡，冰上放置1 h，4 ℃，13 000 g离心力下，离心15 min，转移蛋白样品到新EP管中，经BCA试剂盒定量后，加入5×上样缓冲液，混匀，100 ℃加热变性5 min。通过12 % SDS-PAGE电泳分离后，转膜至PVDF膜上。分别加入一抗(一抗稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。用TBST 洗膜后，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶6 000)37 ℃孵育1 h，TBST 洗涤PVDF膜5次， 10 min/次，加入ECL显影剂后，通过X光胶片曝光。

1.2.5 活性氧ROS检测 参考试剂盒方法，按照1∶1 000用无血清DMEM培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μM。将经辣椒碱处理后的细胞，悬浮于稀释好的 DCFH-DA液中，37 ℃细胞培养箱内孵育30 min。用无血清DMEM培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。流式细胞仪检测荧光强度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 辣椒碱促进CRC细胞炎性因子释放

为了探究炎症在辣椒碱促进CRC细胞转移中发挥的作用，检测了经处理后的CRC细胞培养液中炎性因子的变化。采用辣椒碱处理CRC细胞SW480和HCT116后，通过ELISA 检测IL-1β、IL-6及TNF-α的表达量，发现3者均明显升高(图 1)。

图 1 ELISA法检测炎性因子的释放±s)

注：A：采用ELISA法检测100 μM辣椒碱处理SW480细胞后，细胞上清中炎性因子分泌量的变化；B：采用ELISA法检测12.5 μM辣椒碱处理HCT116细胞后，细胞上清中炎性因子分泌量的变化。与对照组比较，**P<0.01

2.2 辣椒碱通过激活NLRP3炎性小体进而诱导CRC细胞转移

NLRP3炎性小体是炎症中最经典的调控元件。为了验证NLRP3在辣椒碱诱导的CRC炎症反应中是否被激活，Western Blot法检测辣椒碱单独处理后，CRC细胞SW480和 HCT116中NLRP3的表达水平，结果表明NLRP3炎性小体被激活，同时E-cadherin蛋白水平下调、Vimentin蛋白水平上调。为进一步明确NLRP3炎症小体参与辣椒碱诱发的CRC转移过程，本研究采用NLRP3特异性抑制剂MCC950单独或者与辣椒碱共同处理细胞，用Transwell法检测辣椒碱对CRC细胞迁移能力的影响。并用ELISA法检测到用抑制剂处理后炎性因子释放量减少(图2),Transwell 实验检测到MCC950能抑制辣椒碱对CRC转移的促进作用(图3)，并且Western Blot检测结果显示，MCC950和辣椒碱共处理细胞后，E-cadherin蛋白水平上调、Vimentin蛋白水平下调(图4)。以上实验结果表明，辣椒碱依赖于NLRP3炎性小体的活化进而诱导结肠癌细胞转移。

图2 ELISA法检测炎性因子的释放±s)

注：A：采用ELISA法检测100 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理SW480细胞后，细胞上清中炎性因子分泌量的变化；B：采用ELISA法检测12.5 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理HCT116细胞后，细胞上清中炎性因子分泌量的变化。与对照组比较，**P<0.01； 与辣椒碱处理组比较，*P<0.05，**P<0.01

图3 Tanswell法检测细胞的迁移能力

图4 Western Blot检测NLRP3和EMT相关标志性蛋白

注：A：采用Western blot法检测100 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理SW480细胞后，EMT相关标志性蛋白的变化；B：采用Western blot法检测12.5 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理HCT116细胞后，EMT相关标志性蛋白的变化

2.3 辣椒碱通过增加胞内 ROS 的表达水平来激活NLRP3炎性小体

据文献[10-11]报道，在CRC细胞发生炎症反应时，胞内ROS能明显增加NLRP3的表达量。 在前期研究[7]中，发现CRC细胞经辣椒碱处理后，细胞内ROS水平明显上调。为了验证辣椒碱是否通过上调胞内ROS水平来诱发炎症反应，本研究用辣椒碱和NAC共处理CRC细胞，发现辣椒碱处理后的细胞，胞内ROS 的表达量明显增加，而NAC能明显逆转辣椒碱诱发的ROS含量和NLRP3表达量的上升( 图5～6)。以上结果表明，辣椒碱通过上调胞内ROS 的表达水平来激活NLRP3炎性小体，诱发炎症反应进而促进其转移。

图5 流式细胞仪检测ROS 的表达水平±s)

注：A：采用流式细胞术检测100 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理SW480细胞后，胞内ROS含量的变化；B：采用流式细胞术检测12.5 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理HCT116细胞后，胞内ROS含量的变化。与对照组比较，*P<0.05；与辣椒碱处理组比较，*P<0.05

图6 Western Blot检测NLRP3的表达水平

注：A：采用Western blot法检测100 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理SW480细胞后，NLRP3蛋白水平的变化；B：采用Western blot法检测12.5 μM辣椒碱单独处理或与MCC950共处理HCT116细胞后，NLRP3蛋白水平的变化

3 讨论

CRC是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在我国其发病率居恶性肿瘤的第 3 位。而肿瘤转移是癌症复发的主要原因。早有研究[12-15]报道，上皮间质转化(EMT)是肿瘤转移的先驱事件，它是表皮细胞转变为间质细胞的过程。其中，EMT 发生的重要分子变化就是E-cadherin蛋白的减少和Vimentin 蛋白的增加。本课题组前期研究[7]证明，低浓度辣椒碱能诱导CRC细胞发生EMT，进而促进CRC转移，但辣椒碱诱导EMT发生的具体分子机制仍需进一步研究。

炎症是恶性肿瘤转移的主要驱动力，并且肿瘤相关炎性能促进EMT进程，而肿瘤炎症微环境增强了肿瘤的侵袭和转移能力[16]。NLRP3炎性小体是主要的炎症调控元件，据文献[17]报道，炎性小体在炎症驱使的肿瘤发展中起着重要的作用，如CRC。本研究发现，在用辣椒碱处理CRC细胞后，NLRP3蛋白量明显上调。而用NLRP3的特异性抑制剂MCC950处理细胞，则能解除辣椒碱的促转移作用。结果证明，辣椒碱是通过激活NLRP3炎性小体来诱发炎症反应，从而促进CRC细胞的转移。

另有文献[18-19]报道，氧化应激能够加快肿瘤细胞死亡达到肿瘤治疗的目的， 作为机体发生氧化应激反应产生的主要分子，活性氧( ROS)主要是通过诱导细胞凋亡、坏死及自噬性死亡近而抑制癌症发展。在本研究中，发现辣椒碱能促进CRC细胞内ROS的增加，而加入NAC能逆转辣椒碱诱导的ROS上升，并且能阻断辣椒碱的促转移作用，说明ROS在辣椒碱介导的CRC转移中发挥了关键性作用，但辣椒碱诱导ROS产生的分子机制尚存在疑惑，需更深层次的研究。

综上所述，本研究发现辣椒碱能诱导ROS产生进而激活NLRP3炎性小体，从而诱导CRC细胞发生EMT并促进CRC转移。本研究为CRC的预防及癌症患者的清淡饮食习惯提供了理论依据。