福菜乳杆菌CQ16Z1菌株的鉴定及益生特性的研究*

杜 昕，谭明证，代富英，潘 渠

成都医学院 病原生物学教研室(成都 610500)

乳杆菌属(Lactobacillus)能利用多种碳水化合物产生乳酸，为安全无害的微生物[1]。乳杆菌常见于植物体表、传统发酵食品、乳制品、人和动物肠道中。它们常常作为益生菌广泛应用于维持肠道菌群平衡，治疗肠道和心理疾病[2-4]。

新的乳杆菌种仍在不断被发现。2017年，Afouda等[5-7]发现了9种新的乳杆菌。笔者在重庆农家自制泡姜中发现了乳杆菌CQ16Z1菌株。通过分子鉴定和生化表型测定，CQ16Z1菌株被鉴定为福菜乳杆菌(Lactobacillusfutsaii) 。福菜乳杆菌是2012年在台湾苗栗县传统客家菜福菜中发现的乳杆菌新种，模式种为YM0097T (=JCM17355T=BCRC80278T)[8]。后来在泰国传统发酵食品(Kung-Som) 中也发现了该菌[9]。本研究鉴定了福菜乳杆菌CQ16Z1菌株并对其益生特性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株CQ16Z1分离自重庆农家自制泡菜，福菜乳杆菌模式菌株JCM17355T购自台湾食品工业发展研究所。大肠杆菌E57为笔者实验室保存。人结肠癌细胞系HT-29购自成都尚博生物试剂有限公司。API 50 CHL购自成都古蒙生物科技有限公司。革兰阳性菌基因组提取试剂盒、PCR(Ex Taq)和T载体试剂盒购自大连宝生物公司(TaKaRa)。异硫氰酸荧光素(FITC)购自索莱宝公司。细菌微量生化管购自杭州宾和微生物试剂有限公司。试验采用的主要仪器有：核酸电泳仪(美国 Bio-Rad)、离心机(Thermo scientific)、凝胶成像分析系统(美国 Bio-Rad)、生物安全柜(Thermo scientific 1300 series A2)、恒温培养箱(Thermo scientific)、倒置显微镜(Olympus)、细胞培养箱(Thermo)和酶标仪(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 形态特征观察 菌株在经过细菌处理和固定、乙醇梯度脱水、CO2临界点干燥后上电镜，于扫描电子显微镜下观察菌株形态特征[10]。

1.2.2 生长特性的测定 以2 %(v/v)的接种量将菌株接种于MRS液体培养基中， 37 ℃静置培养24 h，每2 h用酶标仪在600 nm处测一次培养物的吸光度。

1.2.3 生理生化特征 对经过37 ℃恒温培养箱静置培养24 h的菌株进行明胶液化、硝酸盐产气、过氧化氢酶、硫化氢试验及乳杆菌碳源利用能力的测定(采用API 50 CHL试剂盒)，以福菜乳杆菌模式菌株JCM17355T为对照。

1.2.4 分子鉴定 采用热变性温度法(thermal denaturation temperature,Tm)测定G+C含量(mol%)[11]。 采用复性速率检测方法对福菜乳杆菌模式菌株JCM17355T与本试验菌株CQ16Z1进行DNA-DNA杂交试验[12-13]。菌株CQ16Z1的总DNA用革兰阳性菌基因组提取试剂盒提取。采用引物对(正义：5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’; 反义：5’-AAGGAGGTGATCCAGC CGCA-3’)扩增其16S rDNA序列。反应体系：16S rRNA基因通用引物(正义)1 μL、16S rRNA基因通用引物(反义)1 μL、CQ16Z1基因组0.5 μL、Premix ExTaq 10 μL、灭菌水补足体系共20 μL。反应条件为：94 ℃，5 min一个循环。95 ℃，40 s；55 ℃，30 s；72 ℃，125 s；25个循环。最终72 ℃，10 min。用胶回收试剂盒回收PCR 产物，然后进行T-A 克隆，扩增产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，最后利用NCBI网站上的序列比对工具BLAST，在 GenBank数据库中比对测序结果。

1.2.5 耐酸试验 MRS培养基作为基础培养基，在不同pH值(3.0、4.5、6.0、8.5)下，37 ℃恒温培养箱静置培养12 h，考察菌株对不同pH的耐受性。

1.2.6 耐胆盐实验 以4.0 %(V/V)的接种量将菌株CQ16Z1接种于分别含胆酸钠、牛磺石胆酸钠、脱氧胆酸钠、禽胆盐和牛磺鹅脱氧胆酸钠的MRS培养基中，胆酸盐浓度设为(0.03%、0.06 %、0.08 %、0.15 %、0.20 %、0.30 %、0.40 %)，37 ℃静置培养48 h。

1.2.7 细胞黏附能力 以人结肠癌细胞HT-29作为体外模型，大肠杆菌E57为对照，研究菌株CQ16Z1的黏附性能[14-15]。实验步骤简述如下：收集培养好的菌体，用异硫氰酸荧光素标记，和HT-29细胞孵育1 h，洗去没有黏附的细菌，用酶标仪测定细胞悬液荧光。

2 结果

2.1 菌株CQ16Z1 形态特征

菌株CQ16Z1的形态呈长杆状，大小为0.5～0.6 μm × 2.2～4.6 μm，符合乳杆菌属形态特征(图1)。

图1 菌株CQ16Z1扫描电镜照片

2.2 菌株CQ16Z1 的生长特性

菌株CQ16Z1 培养2 h后的OD(吸光度)值较小，其迟缓期应为2 h； 4 h后培养物OD值开始显著升高， 18～36 h，培养物OD值变化缓慢(图2)。生长曲线显示菌株CQ16Z1具备迟缓期短且生长快的特性，有利于实际生产应用。

图2 菌株CQ16Z1的生长曲线

2.3 CQ16Z1 生理生化特征

菌株CQ16Z1的明胶液化、过氧化氢酶、硫化氢、吲哚和硝酸盐利用实验都为阴性，符合乳杆菌属特征。API 50 CHL实验(49个碳源)结果表明，CQ16Z1和亲缘性最近的福菜乳杆菌 JCM17355T菌株在利用葡萄酸盐、半乳糖和核糖上不同。相较于CQ16Z1的弱利用，福菜乳杆菌 JCM17355T却是不能利用。CQ16Z1应该鉴定为福菜乳杆菌。菌株CQ16Z1具有利用半乳糖和纤维二糖的能力，是有价值的益生菌特征。

2.4 菌株CQ16Z1的分子鉴定

菌株CQ16Z1 基因组的G+C mol %是39.1 %，在乳杆菌属G+C mol %的范围中(32%～53 %)；其16S rDNA扩增片段长度为1 559 bp，GenBank数据库编号为：KY242444。BLAST比对结果表明：福菜乳杆菌 JCM17355T菌株的16S rDNA (NR_117973)是与扩增片段最相似的序列，相似值为99.87 %。菌株CQ16Z1与福菜乳杆菌 JCM17355T菌株的DNA-DNA杂交同源性为91.9%。据此将CQ16Z1鉴定为福菜乳杆菌。

2.5 菌株CQ16Z1的耐酸实验

乳杆菌一般可生长于pH≤5.0的环境中。实验表明菌株CQ16Z1不能在pH 3.0条件下生长，但可以在pH 4.5～8.5生长。

2.6 耐胆盐实验结果

菌株CQ16Z1对不同的胆盐都有不同程度的耐受性。最高耐受浓度分别为：0.08 %的胆酸钠和禽胆盐、0.15 %的脱氧胆酸钠和牛磺鹅脱氧胆酸钠、以及0.4 %的牛磺石胆酸钠(表1)。

表1 胆盐耐受结果

2.7 菌株CQ16Z1对HT-29细胞的黏附

菌株CQ16Z1对 HT-29细胞具有很强的黏附能力，黏附率高达85.7 %，条件致病菌大肠杆菌E57的黏附率为57.7 %。

3 讨论

通过对菌株CQ16Z1进行的多相分类鉴定发现，该菌株符合乳杆菌属特征，如菌体为长杆状，不产生过氧化氢酶、硫化氢和吲哚，不液化明胶及G+C mol%为39.1%。且16S rRNA基因序列比对、DNA-DNA杂交和生化实验结果均支持CQ16Z1菌株归属于福菜乳杆菌。故命名为福菜乳杆菌CQ16Z1菌株。通常认为DNA-DNA杂交值>70 %为同一个种,>79 %为相同亚种[16]。然而在实际报道的亚种之中，有些亚种和模式种之间DNA-DNA杂交值是>79 %的，例如，芸苔假单胞菌新亚种(Pseudomonasbrassicacearumsubsp.neoaurantiaca)和模式种之间的DNA-DNA杂交值是90.0 %[17]，德氏乳杆菌的保加利亚亚种(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)和孙氏亚种(L.delbrueckiisubsp.Sunkii)之间杂交值为91.6%[18]，而德氏乳杆菌的印度亚种(L.delbrueckiisubsp.indicus)和雅克布森亚种(L.delbrueckiisubsp.Jakobsenii)之间杂交值更是达到了为99.0%[19]。本研究CQ16Z1菌株和福菜乳杆菌之间的DNA-DNA杂交值是91.9 %，仍有可能是福菜乳杆菌的新亚种。

益生菌具备益生特性，首先其能耐受肠道环境，其次是其必须具备定植在肠道的能力。本研究耐酸实验显示，菌株CQ16Z1可在pH 4.5的酸性环境中生长，提示其可通过胃的酸性环境到达肠道。且在API 50 CHL试验中可知，菌株CQ16Z1具有利用半乳糖和纤维二糖的能力，是有价值的益生菌特征。根据本实验结果，菌株CQ16Z1耐胆盐并对小肠上皮细胞HT-29具有很强的黏附能力，远高于大肠杆菌E57的黏附率，说明其具备益生特性。该菌株的鉴定及益生特性的研究不仅增加了乳杆菌的种质资源，也为其应用开发打下了基础。