刺槐素腹腔注射对局灶性脑缺血小鼠脑再灌注损伤的预防作用及其机制

马志，补娟，朱沂

(1安徽医科大学新疆临床学院，乌鲁木齐 830000；2新疆维吾尔自治区人民医院)

脑卒中是导致成年人死亡和慢性残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中约占80%[1,2]，由于大脑中动脉(MCA)供血区的血栓或栓塞引起的局灶性缺血性卒中为最多见。脑卒中发病率和病死率随年龄的增长而增加，而随着我国老年人口的迅速增长，缺血性卒中给我国社会和家庭带来具大的经济负担[3]。缺血性脑卒中的病理生理机制复杂，缺血再灌注损伤是最主要也是研究最深入的，包括兴奋性毒性、氧化应激、炎症应答、细胞凋亡等[4]。无菌性炎性应答是脑缺血再灌注损伤的关键因素，并且炎症信号参与脑卒中的所有阶段，包括早期损伤事件到后期再生过程的脑组织修复。脑缺血再灌注损伤的炎症应答主要表现为脑缺血坏死区小胶质细胞的激活，释放大量的炎症因子和趋化因子，以及其他有害物质导致神经细胞的坏死，并进一步加重脑缺血损伤[5]，而小胶质细胞作为脑内最主要的免疫细胞被认为是触发脑内免疫炎症应答的启动因子[6]。刺槐素又称刺槐黄素、金合欢素，属黄酮类化合物，普遍存在于维管束植物中，可从菊花、刺槐、雪莲等植物中提取获得，对神经炎症性疾病有保护作用。Lin等[7]通过建立红藻氨酸诱导的兴奋性神经退行性疾病模型，发现刺槐素可减少海马区的神经元死亡，防止兴奋性氨基酸引起的神经毒性作用。Ha等[8]认为，刺槐素能抑制脂多糖诱导的小胶质细胞的活化及多种炎症因子释放，从而发挥神经保护作用。但刺槐素对脑缺血后再灌注损伤是否有预防作用及其可能的机制尚未见报道。本研究观察了刺槐素对局灶性脑缺血小鼠脑再灌注损伤的预防作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年清洁级雄性C57BL/6J小鼠36只，体质量25～30 g，由新疆实验动物研究中心提供[许可证号：SCXK(新)2011-0001]。根据随机数字表法，将所有小鼠随机分为刺槐素组、模型组、对照组各12只。

1.2 局灶性脑缺血模型制备及刺槐素给予方法 实验环境中适应3 d，自由饮水。刺槐素组和模型组小鼠参照文献[9]方法制备右侧局灶性脑缺血模型；腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉(剂量根据小鼠体质量计算)，待麻醉成功后将小鼠以仰卧位固定齿及四肢；手术显微镜下行颈部正中纵行切口(5～6 mm)，依次钝性分离及暴露右侧颈总动脉、右侧颈外动脉及右侧颈内动脉，暂时夹闭颈总动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉远心端并小心电离凝断颈外动脉，于颈外动脉残端插入尼龙线(硅胶包被线栓)至大脑中动脉；缺血60 min抽出尼龙线，恢复脑血流再灌。对照组小鼠仅分离颈内动脉，但不闭塞大脑中动脉。术中及术后3 h注意使用白炽头灯，使小鼠肛温控制在(37±0.5)℃。刺槐素组和模型组分别于再灌注时给予腹腔注射刺槐素(25 mg/kg)和等量0.9%生理盐水，对照组于相同时间点腹腔注射等量刺槐素。术后各组小鼠正常饮食和饮水，单笼饲养。

1.3 小鼠神经功能评价 制模24 h后，各组小鼠按照文献[9]方法进行神经功能评分。由两位未参与分组及局灶性脑缺血手术的研究人员根据小鼠前爪、转圈、意识等情况进行评分，无神经功能损伤症状或体征计0分，不能完全伸展对侧前爪计1分，向瘫痪侧转圈计2分，向瘫痪侧倾倒计3分，不能自发行走、意识丧失或死亡计4分。

1.4 小鼠脑梗死体积测算 神经功能评分后，立即采用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速断头取脑组织，放于-20 ℃冰箱快速冷冻，按1 mm厚度进行冠状切片，然后将切片放入1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中，37 ℃恒温箱孵育染色20 min，可观察到正常脑组织染成红色，而缺血侧脑组织则被染为白色并且可见组织肿胀，梗死区域与非梗死区域梗死界限明显。然后用生理盐水冲洗脑片3次，后置于4%多聚甲醛中固定2 h。采用 Image pro plus6.0软件测量各区面积，并计算梗死灶体积，梗死灶体积：V=Σ(S1+S2)×d/2，其中V为总体积，S1和S2分别表示切片头侧和尾侧面积，d为切片厚度。

1.5 小鼠海马区、皮层区Iba-1阳性细胞数计数 0.5%的戊巴比妥钠深麻醉小鼠后开胸暴露心脏，经左心室分别灌注生理盐水和4%多聚甲醛后取脑，置于4%多聚甲醛中固定过夜。在前卤后2～5 mm连续冠状切片，片厚5 μm，附于多聚赖氨酸包被的载玻片备用。切片经常规脱蜡、水化、微波抗原修复后，按试剂说明书以SP法进行离子钙接头蛋白1(Iba1，1∶500)免疫组化染色，二氨基联苯胺(DAB)显色。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，镜下观察脑组织切片，Iba1阳性细胞胞核为棕褐色。每只小鼠随机选取海马区和皮层区各5个高倍视野(×400)，应用Image pro plus 5.0 软件计数Iba1阳性细胞。

2 结果

2.1 各组小鼠神经功能评分比较 刺槐素组、模型组、对照组小鼠神经功能评分分别为(1.67±0.52)、(2.83±0.41)、0分，刺槐素组与模型组比较，P<0.05。

2.2 各组小鼠脑梗死体积比较 刺槐素组、模型组、对照组小鼠梗死体积分别为(22.15±3.85)、(70.48±12.57)、0 mm3，刺槐素组与模型组比较，P<0.05。

2.3 各组小鼠海马区、皮层区Iba-1阳性细胞数比较 结果见表1。

表1 各组小鼠海马区、皮层区Iba-1阳性细胞数比较(个

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

随着我国老龄人口比重的加大，脑卒中的发病率必会逐年增加。虽然近年来脑卒中的病理机制研究已取得较大进展，但向临床应用的转化效果仍不理想。重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)依然是当前治疗缺血性脑卒中的主要药物，但是由于其严格的治疗时间窗及出血等不良反应，极大地限制了其在临床的应用。当脑缺血发生后，由于血流的突然中止，氧糖剥夺，随之而来能量的耗竭、细胞内离子的失衡，在随后的再灌注复氧阶段，大量的活性氧簇的产生，磷脂、蛋白及DNA的损伤以及炎症的激活，出现细胞肿胀、细胞结构的破坏，从而诱导细胞凋亡和死亡[10]，表现为脑组织的肿胀、坏死和软化，从而引起一系列的神经功能缺损表现。这其中炎症应答为关键因素，由于炎症反应的损伤效应可持续数小时至数周，为靶向于炎症反应的神经保护治疗提供了时间窗，所以控制脑缺血损伤后的炎症应答可能成为缺血性脑卒中治疗的重要靶点。

刺槐素为0位甲基化的黄酮类化合物，广泛分布于植物色素，构成了自然界中的多种颜色。刺槐素的化学结构较简单，从植物中分离纯化较容易，且近年研究[11～13]表明其具有外周抗氧化、抗炎、杀疟原虫效果以及抗肿瘤活性，具有良好的应用前景。但刺槐素对局灶性脑缺血后再灌注损伤的预防作用尚未明确。

TTC染色能反应出线粒体的功能状态，即能很好的显示出脑缺血再灌注后的脑组织梗死情况[14]。同时对小鼠进行局灶性脑缺血神经行为学评价,既能反映缺血再灌注模型成功与否也能反映出脑缺血再灌注的病理生理过程、组织损伤情况。本研究发现，对照组TTC染色未见梗死发生，神经功能评分亦未见缺损表现，而刺槐素组较模型组上述指标都有显著改善，说明刺槐素能减少缺血再灌注损伤后小鼠的脑梗死体积，改善梗死后的神经功能缺损症状，刺槐素对局灶性脑缺血小鼠再灌注损伤有预防作用。

小胶质细胞作为中枢神经系统特化的巨噬细胞，是参与脑内神经炎症反应的主要免疫细胞。在生理状态下，小胶质细胞具有组织防御和保护的作用，支持神经元的功能并维护内环境的稳态，小胶质细胞采用一个高度分支的形态[15]，这个分支形态是以长细胞分枝突起和小细胞胞体为特征，同时细胞分枝不断移动而胞体保留在原位，能持续不断的侦查脑微环境动态平衡的任何改变。当危险出现时，小胶质快速活化，即采用大细胞体、少分枝和更加阿米巴形的表型，激活后这些细胞快速作出适当的应答以应对新出现的威胁[16,17]。脑缺血再灌注损伤后，小胶质细胞能够在脑缺血后数分钟内激活，并迅速增殖、迁徙以及释放过氧化物、NO及炎症因子等，从而加重脑缺血再灌注损伤[18]。小胶质细胞通过其细胞表面丰富的模式识别受体感知中枢神经系统内环境中的各种危险信号。当神经元细胞损伤后释放出相关的“损伤相关分子模式”与小胶质细胞表面的模式识别受体结合从而触发下游的免疫应答。比如释放自坏死的神经元细胞的高迁移率族框1(HMGB1)，HGBM1通过小胶质细胞上Toll样受体介导卒中后小胶质细胞激活[19]。而抗HMGB1抗体治疗减轻了卒中后脑损伤[20]。而本课题组前期研究也发现，通过下调缺血后TLR4表达，雪莲注射液能够抑制小胶质细胞增殖及肿瘤坏死因子-κB(NF-κB)活化，减小梗死体积[21]。小胶质细胞表面的模式识别受体除了Toll样受体家族(TLR)外，还包括晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、NOD样受体家族(NLR)、细胞因子受体以及Notch信号等，比如Fang等[22]研究发现RAGE可在小胶质细胞上表达并诱导NF-κB和MAPK信号通路，引起TNF-α和IL-1β等多个促炎性因子的释放。小胶质细胞通过表面的受体及相关的信号通路形成一个相互作用、相互补充的炎症阶联反应网络来完成卒中后的免疫应答。另外，Iba1是一种能特异性的表达在脑内小胶质细胞中的离子钙接头蛋白，当脑缺血发生时小胶质细胞内Iba1的表达随之增加，故而Iba1常故而小胶质细胞的标志物[23]。本研究显示，刺槐素组和对照组小鼠海马区、皮层区Iba-1阳性细胞数较模型组少，提示在脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞大量扩增并激活，并且刺槐素能通过抑制小胶质细胞的增殖及激活，从而抑制小胶质细胞活化后的炎症信号通路的启动来保护神经元细胞。

总之，刺槐素对局灶性脑缺血小鼠再灌注损伤有预防作用，其机制可能与抑制小胶质细胞的增殖及激活，从而抑制小胶质细胞活化后的炎症信号阶联反应有关。