不同剂量甲基阿魏酸灌胃对大鼠酒精性肝病的治疗作用及其机制探讨

程琪，贺鹤，朱芳婵，李丽，杨成芳，钟毓娟，李勇文

(桂林医学院，广西桂林 541000)

长期过度饮酒会导致不同程度的酒精性肝病(ALD)[1]，从酒精性脂肪性肝炎演变为酒精性脂肪肝，最后阶段是酒精性肝硬化，是不可逆转的，有较高的发病率和病死率[2,3]。ALD发病机制复杂，主要有酒精摄入过量、遗传因素、营养不良和氧化应激损伤等原因[4]。氧化应激损伤在ALD的发展中起至关重要的作用，然而对于氧化损伤的有效治疗药物仍然缺乏[5]。甲基阿魏酸(MFA)是从蝉翼藤中提取的一种单体，蝉翼藤具有较强的抗菌抗炎、抗病毒、免疫增强等功能[6]。本课题组前期研究表明，MFA可抑制乙醇诱导的L-02细胞凋亡和大鼠肝脏脂代谢紊乱[7,8]。本研究采用酒精灌胃法制备ALD大鼠模型，同时给予MFA进行干预，观察MFA对大鼠ALD的治疗作用，并探讨其可能机制，旨在为MFA用于治疗ALD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性成年SD大鼠60只，体质量180～220 g，由桂林医学院实验动物中心提供[实验动物使用许可证号为SCXK(桂)2016-0050]。将大鼠饲养于SPF级屏障动物房内，房间温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%，自由进食进水。

1.2 药物、试剂及仪器 MFA(美国Sigma公司)。无水乙醇(AR级，汕头市西陇化工有限公司)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(桂林优利特医疗电子有限公司)；过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒(北京市天根生化科技有限公司)；RIPA裂解液(强)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强剂,南通市碧云天生物技术研究所)；兔抗B淋巴细胞瘤2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3,上海生工生物工程股份有限公司)；β-actin抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。Model 680型酶标仪、T100TM PCR扩增仪和Chemi Doc型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；XL-600全自动生化分析仪(德国Erba公司)。

1.3 实验动物分组及MFA给予方法 将60只大鼠随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组、正常组各12只。低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组大鼠给予酒精灌胃诱发ALD，酒精剂量先增加后减少，第1～2周为2 g/(kg·d)，第3～4周为4 g/(kg·d)，第5～6周为6 g/(kg·d)，第7～10周为8 g/(kg·d)，然后再减至2 g/(kg·d)；每天灌胃1次，连续16周。以16周后大鼠血清ALT、AST水平升高为构建ALD模型成功。正常组大鼠只灌胃相同体积的生理盐水。从第13周开始，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃5、10、20 mg/kg的MFA，模型组和正常组给予等体积的溶媒，1次/d，连续4周。

1.4 大鼠体质量、肝脏指数测算及肝脏组织病理学检查 16周末，称大鼠体质量。称重后将所有大鼠施行安乐死，收集肝脏组织，磷酸盐缓冲液冲洗肝脏，用滤纸轻轻拭干并立即称重，计算肝脏指数，肝脏指数(%)=肝脏质量(mg)/体质量(g)×100%)。各组随机选取3只大鼠的肝脏组织，固定位置，用中性甲醛溶液固定，经脱水、石蜡包埋、切片(厚5 μm)、脱蜡后，进行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理变化。

1.5 大鼠血清ALT、AST及肝脏组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA检测 每组随机选取3只大鼠，腹主动脉采血，通过离心(3 000 r/min，4 ℃)20 min获得大鼠的血清样品。按照试剂盒说明书，采用生化分析仪检测血清ALT、AST。另外，每组随机选取3只大鼠肝脏组织(100 mg)制备肝脏组织匀浆，按照试剂盒方法检测肝脏组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA。

1.6 大鼠肝脏组织Bax蛋白/Bcl-2蛋白、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相对表达量比值测算 每组随机选取3只大鼠，固定位置取肝脏组织100 mg，放入玻璃匀浆器中。加入1 mL RIPA组织裂解液(含有5 μL磷酸酶抑制剂和10 μL蛋白酶抑制剂)，于冰上充分匀浆，裂解物置于冰上10 min，离心(13 000 r/min，4 ℃)10 min。取上清，BCA法进行蛋白定量。加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于100 ℃煮沸5 min。12%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，将PVDF膜用5 %脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜。用Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Caspase-3(1∶500)、cleaved-Caspase-3(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃摇床过夜。TBST洗膜除去过量的一抗，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶8 000)室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL化学发光法进行发光，X射线胶片显影。胶片扫描后测定蛋白灰度值。以β-actin为内参，计算目标蛋白相对表达量以及Bax蛋白/Bcl-2蛋白、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相对表达量比值。

1.7 大鼠肝脏组织Bax mRNA/Bcl-2 mRNA相对表达量比值测算 每组随机选取3只大鼠，固定位置取肝脏组织100 mg，按照总RNA提取试剂盒(离心柱型)Simple Total RNA kit说明书提取肝脏总RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA含量及纯度，OD260/OD280在1.8～2.0。并按照逆转录试剂盒Fast Quant RT kit(with gDNase)说明书逆转录得cDNA。查找基因序列并设计引物，Bax引物序列：5′-agacaggggcctttttgctac-3′，5′-aattcgccggagacactcg-3′；Bcl-2引物序列：5′-ggtggggtcatgtgtgtgg-3′，5′-gggttcaggtactcagtcatcc-3′；β-actin引物序列：5′-tgttaccaactgggacgaca-3′，5′-ggggtgttgaaggtctcaaa-3′。然后再进行PCR扩增，PCR反应总体积为25 L，热循环条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，50～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环后于72 ℃延伸10 min。反应结束后分别取10 L扩增产物和5 L DNA Marker上样，进行2%琼脂糖凝胶电泳。Bio-Rad自动凝胶成像分析系统检测OD值，Quantity One软件进行分析，以β-actin为参照物。计算Bax mRNA/Bcl-2 mRNA相对表达量比值。

1.8 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、肝重、肝脏指数比较 结果见表1。

表1 各组大鼠体质量、肝重、肝脏指数比较

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

2.2 各组大鼠肝脏组织病理学比较 ①肉眼观：正常组大鼠肝脏呈红褐色，包膜光滑，边缘锐利，质地适中；模型组大鼠肝脏颜色泛白，体积增大，包膜紧张，切面油腻，边缘变钝；低、中、高剂量组介于正常与模型组之间，其中高剂量组肝脏外观接近正常组。②光镜下：正常组大鼠肝脏结构形态正常，无明显病变；模型组中央静脉扩张，肝窦扩张，肝细胞排列紊乱，显著肿大，边界模糊，胞质中充满脂肪泡，出现明显脂肪变性，同时可见炎性细胞浸润、变性、坏死等现象；中、高剂量组大鼠肝脏损伤程度有明显改善，大鼠肝细胞变性和坏死程度明显减轻。

2.3 各组大鼠血清ALT、AST水平比较 结果见表2。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

2.4 各组大鼠肝脏组织CAT、GSH-Px、SOD、MDA表达比较 结果见表3。

表3 各组大鼠肝脏组织SOD、GSH-Px、MDA、CAT表达比较

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

2.5 各组大鼠肝脏组织Bax蛋白/Bcl-2蛋白、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相对表达量比值比较 结果见表4。

3 讨论

ALD是临床上常见的肝脏疾病，主要是由于长时间大量饮酒所引发的肝脏损害性病变。近年来，随着我国人民生活水平的提高，ALD的发病率呈逐年上升趋势，对人们的身体健康造成严重危害。目前，ALD的治疗尚缺乏有效的方法[9,10]，主要采取戒酒、补充营养及美他多辛、水飞蓟宾类、S-腺苷甲硫氨酸等药物治疗[11]，治疗方法非常局限，往往达不到预期效果。因此，寻找能有效治疗ALD且不良反应小的新药尤为迫切。中草药在预防和治疗ALD方面表现出多靶点、低毒性、疗效较为确切的优势，显示出了良好的前景[12]。MFA是从中草药蝉翼藤的根茎中提取纯化后得到的一种单体[6]，我们前期研究发现其可以抑制乙醇和CCl4诱导的大鼠肝纤维化，且无明显不良反应[13,14]。酒的主要成分是乙醇，长期酗酒，乙醇及其代谢产物会导致肝损伤。众所周知，血清转氨酶是肝损伤的敏感标志。Sun等[15]研究表明，乙醇可以诱导酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平升高。本研究显示，ALD大鼠体质量明显减轻而肝重显著增加，因此肝脏指数增大；MFA干预后可以显著抑制ALD大鼠肝脏指数增大。此外，ALD大鼠肝脏组织出现严重的病理改变，并且血清中ALT和AST水平显著升高；MFA干预后可以改善肝脏酒精性病理改变，且随着剂量增加，ALD大鼠血清中ALT、AST水平明显降低，说明MFA具有抗ALD的作用。

表4 各组大鼠肝脏组织Bax蛋白/Bcl-2蛋白、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

乙醇摄入过多会在肝内代谢产生活性氧(ROS)，肝脏内过量的ROS介导肝脏脂质代谢紊乱以及肝细胞脂质过氧化，使肝细胞膜稳定性变差，炎症因子释放增多，肝细胞凋亡增加，最终导致ALD[16]。体内脂质过氧化产生大量MDA，与氧化应激反应密切相关。此外，长期酗酒导致肝脏中抗氧化因子如SOD、GSH-Px和CAT等酶类大量消耗，使得肝脏清除ROS能力下降，体内氧化还原平衡被打破，引发氧化应激反应[17]。本研究显示，MFA可显著提高ALD大鼠肝脏中SOD、GSH-Px和CAT含量，并明显降低MDA含量，起到对抗乙醇诱导的氧化应激损伤的作用，且呈剂量依赖式。

Bcl-2家族和Caspase家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Bcl-2家族中Bax发挥促凋亡作用，相反Bcl-2发挥抗凋亡作用，二者共同决定细胞生死[18]。Caspase-3是Caspase家族的成员之一，也是细胞凋亡的中心效应因子。酒精引起肝脏氧化应激反应也可通过调控细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax的表达，进而活化Caspase-3，诱导肝细胞凋亡[19]。本研究显示，MFA可抑制乙醇诱导的ALD大鼠肝脏中Bax/Bcl-2蛋白、mRNA表达比值，抑制cleaved-Caspase3/Caspase-3蛋白表达比值，从而抑制细胞凋亡，发挥抗ALD作用。

总之，MFA对大鼠ALD有治疗作用，且高剂量效果更佳，其机制可能为减轻ALD发病关键环节氧化应激及细胞凋亡程度。