明目消朦预处理对H2O2诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡及氧化应激损伤的影响

袁灵梅，贾洪亮，王燕，袁远，尚亚南，曾志奎，邱波

(1江西中医药大学附属医院，南昌 330006；2广东省中医院；3解放军第一五二中心医院)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)最常见的微血管并发症之一，随着DM患者人数的快速增长和人口老龄化的加剧，其发病率逐步增加。DR是视网膜微血管长期累积损伤的结果，氧化应激是DR发病机制中的重要因素之一。研究表明，明目消朦(MMXM)对DR有效，包括单纯期及增殖期DR。前期研究[1]表明，MMXM可抑制DM大鼠体内的自由基毒素，改善体内氧化-抗氧化平衡状态，减少视网膜新生血管形成，而其对DR氧化应激的影响有待进一步探讨。本研究通过H2O2制备人视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)氧化应激损伤模型，探讨MMXM对RPE细胞凋亡及氧化应激损伤的影响，旨在为MMXM治疗DR的功能性作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器 MMXM(广东省中医院)，将2片(0.5 g/片)MMXM加入5 mL基础培养基中充分溶解，用0.22 μm过滤器过滤除菌，将配置好的MMXM母液(200 mg/mL)放入4 ℃保存备用。DMEM(美国Hyelon公司)，新生牛血清(美国Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)，链霉素(广州威佳科技有限公司)，青霉素(哈药集团制药厂)，DMSO(广州威佳科技有限公司)，30%过氧化氢(广州化学试剂厂)，Muse Multicaspase Kit(Millipore)，Muse Oxidative stress Kit(Millipore)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)试剂盒(南京建成)，其他分析纯试剂(广州化学试剂厂)。台式高速冷冻离心机(Heal Force)，纯水仪(青岛富勒姆科技)，流式细胞仪(Milipore)，涡旋混合器(Servicebio)，全自动研磨仪(武汉康涛科技有限公司)，酶标检测仪(Rayto)，0.22 μm过滤器(广州威佳科技有限公司)。

1.2 RPE细胞培养 获取冻存的RPE细胞，实验前对细胞进行复苏。将恒温水浴缸预热至37 ℃，从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37 ℃水浴中不断轻摇冻存管使其完全融化。用75%酒精喷拭冻存管表面，转入无菌操作台内用移液枪向冻存管内加入完全培养基500 μL，500 r/min离心5 min。吸除上清液后加入完全培养基1 mL吹打重悬细胞。向准备的培养皿内加入完全培养基(细胞培养基为含10%血清，链霉素100 μg/ mL，青霉素100 U/ mL的DMEM)，用移液枪将细胞悬液移入培养皿。将细胞培养皿放入5%CO2、37 ℃培养箱中培养。第2天细胞换液，之后2～3 d换液1次，待细胞生长至80%～90%时进行细胞传代。

1.3 RPE细胞分组及MMXM应用方法 取对数生长的细胞，按2×105/mL密度接种于含完全培养基的6 cm培养皿中，24 h细胞贴壁后，吸除旧培养基，更换无血清的基础培养基。将细胞分为4组，A组加入含MMXM的无血清培养基，MMXM的终浓度为0.5 mg/mL，24 h后加入200 μmol/mL的H2O2(以制备氧化应激损伤模型)；B组加入无血清的基础培养基，24 h后加入200 μmol/mL的H2O2；C组加入含MMXM的无血清培养基，MMXM的终浓度为0.5 mg/mL；D组加入无血清的基础培养基；4组细胞处理保持同步。24 h后同时取出4组细胞，常规胰酶消化离心细胞，得到各组细胞沉淀。

1.4 RPE细胞凋亡率测算 预先按说明书配制好调亡试剂(Multicaspase Reagent)。将Caspase Buffer 10×(100 μL)加900 μL的ddH2O稀释至1×(1 000 μL)。细胞常规消化收集加入1×PBS 100 μL重悬细胞。将准备好的4个1.5 mL离心管内分别加入1×Caspase Buffer 50 μL和Multicaspase Reagent 5 μL后混匀。上述混匀液加入10 μL细胞悬液混匀。1.5 mL离心管避光条件下置于37 ℃孵育30 min。剩余的1×Caspase Buffer加入7-AAD原液5 μL配制成7-AAD工作液。离心管从37 ℃培养箱取出，在避光条件下各加入7-AAD工作液150 μL，避光室温孵育5 min。用流式细胞仪检测各组细胞调亡的结果，以调亡率来表示。

1.5 RPE细胞氧化应激损伤指标检测 ①ROS检测:预先按说明书配制好Oxidative stress工作液。细胞常规消化收集加入1×PBS 100 μL重悬细胞。取上述细胞悬液10 μL加入190 μL Oxidative stress工作液混匀。避光条件下置于37 ℃孵育30 min。用流式细胞仪检测ROS结果。②MDA检测：准备4个离心管，标准管、空白管分别加入a*标准品、无水乙醇，测定管、对照管加入a*样本，4个管同时加入a*的试剂一(a*表示所取的样本量、无水乙醇、标准品量、试剂一的量，四者均相等)，标准管、空白管、测定管再加入3 mL试剂二和1 mL试剂三,对照管加入3 mL试剂二和1 mL 50%冰醋酸。加样完成后用旋涡混匀器混匀，用保鲜薄膜将试管口扎紧，针头在保鲜薄膜上刺一个小孔，95 ℃沸水反应40 min，取出后用流水冷却，然后3 500～4 000 r/min，离心10 min(3 000 r/min以下离心时间需延长，目的使沉淀完全)。取上清，532 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。MDA含量(nmol/mg protein)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标品浓度(10 nmol/mL)/样品蛋白浓度(mg protein/mL)。③SOD检测： 测定管和对照管各加入1 mL试剂一后分别加等量的样品和蒸馏水，再加入0.1 mL试剂二、三、四，然后用旋涡混匀器充分混匀，37 ℃恒温水浴40 min后加入2 mL显色剂。混匀，室温放置10 min，于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。SOD活力(U/mg protein)=(对照OD值-测定OD值)/对照OD值×0.5×反应体系稀释倍数/待测样本蛋白浓度(mg protein/mL)。④GSH-PX检测：测定管和对照管按说明书流程加入试剂一、试剂二及样品，混匀，3 500～4 000 r/min，离心10 min，取上清1 mL。空白管加GSH标准品溶剂1 mL，标准管加20 μmol/L GSH标准液的1 mL，4个离心管同时加入试剂三、四、五，混匀，室温静置15 min后，412 nm处，1 cm光径比色杯，双蒸水调零，测各管OD值。GSH-PX活力=(非酶管OD值-酶管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(20 μmol/L)×稀释倍数(5)/反应时间/(取样量×蛋白浓度)。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较 A、B、C、D组细胞凋亡率分别为17.83%±1.71%、46.02%±2.34%、6.65%±0.88%、6.27%±0.97%，B组与其余3组比较，A、B组与C、D组比较，P均<0.05。

2.2 各组细胞ROS、MDA、SOD、GSH-P比较 结果见表1。

表1 各组细胞ROS、MDA、SOD、GSH-P比较

注：与D组比较，△P<0.05；与B组比较，*P<0.05。

3 讨论

DM是一种影响全身各个脏器和组织血管糖代谢紊乱的内分泌性疾病。DR是DM的严重并发症，为工作年龄段成人新发失明的主要原因。微血管瘤、浅层或深层出血、硬性渗出、棉绒斑、静脉串珠样、黄斑水肿等是DR的病变特点，后期随着新生血管的出现，DR进入增殖期。RPE细胞是视网膜光感受器的调节中起重要作用的视网膜细胞层，其在运输和储存材料中起作用，例如吞噬分离的感光细胞外节，遮光，去除自由基，合成细胞因子，并形成血-视网膜屏障。故我们应用DR发展过程中发挥重要作用的RPE细胞[2～5]开展实验研究，并通过H2O2诱导细胞建立氧化应激模型。

DR治疗相当棘手，有效治疗轻中度非增殖期DR的药物尚少，而且适用于高危非增殖期及增殖期糖尿病视网膜患者的激光光凝可能损伤视网膜，抗VEGF治疗费用昂贵，且部分患者存在无应答的情况。因此，找寻有效、价格适中且不良反应少的治疗方法是亟待解决的问题。中医药治疗DR的研究取得了一定进展，不少研究结果证明DR应用中医药治疗具有良好的前景[6～9]。MMXM主要由蒺藜、五味子、密蒙花等中药组成。蒺藜含有类固醇、皂甙、类黄酮等天然动态物质，蒺藜提取物具有抗氧化和清除自由基的特性；类黄酮是一种抗氧化剂，可以降低ROS[10]。文献[11,12]报道，五味子亦具有强大的抗氧化功效。中医学认为，DR以气阴两虚为本虚，瘀血阻络为标实。故中医治疗DR多从益气养阴补其虚，活血通络、化痰散瘀治其标。MMXM具有益气养阴、活血化瘀、化痰、明目的功能。方中补泻兼施，寒温并用，补中有泻，寒中有热。全方合用诸药，既能针对DM的阴虚之本，又能兼顾早期的气阴两虚之特点既能针对瘀血、痰湿等实证之标，又能凉血止血而不留瘀血、化痰散结不伤正。MMXM在治疗眼底病方面能改善视网膜微循环障碍，改善视网膜的缺血缺氧状态，从而促进视网膜渗出、出血的吸收，对改善气阴两虚、痰瘀互结的中医证候疗效满意。

氧化应激是DR的重要机制，可直接导致DM视网膜细胞功能障碍或细胞凋亡[13～15]。氧化应激可能由于代谢应激的持续循环，组织损伤和细胞死亡而被放大，导致自由基产生增加并且损害了自由基抑制性清除剂系统，而这又进一步加剧了氧化应激。研究指出，DM并发症的所有机制似乎都与活性ROS过量产生有关[16]。ROS与脂质的特定反应通常称为“脂质过氧化”，脂质过氧化过程的主要产物是MDA[17,18]。本研究显示，与B组比较，其余3组细胞凋亡率降低；与C、D组比较，A、B组细胞凋亡率升高。与D组比较，A、B组ROS(+)、MDA升高，ROS(-)降低；与B组比较，其余3组ROS(-)升高，ROS(+)、MDA降低。人体自身配备了一个高效的抗氧化防御系统，其中包括多种抗氧化酶，抗氧化物被认为是检测自由基并防止它们对其他细胞造成损害的第一道防线[19]。SOD是一种内源性的抗氧化剂，几乎所有的细胞中都存在SOD。GSH是一种胞内抗氧化剂，在细胞中重要的防御,它可以充当ROS清除剂和调节细胞内氧化还原状态[20]。GSH-PX在DM患者中丧失其活性和抗原性，谷胱甘肽氧化还原反应，生物合成和降解受到影响。本研究显示，与D组比较，A、B组SOD、GSH-PX降低；与B组比较，其余3组SOD、GSH-PX升高。当抗氧化酶和抗氧化物消耗时，氧化应激导致细胞损伤[21]。

总之，MMXM能有效减少H2O2介导的RPE细胞凋亡，并可预防细胞氧化损伤。