基因芯片与液体快速培养技术诊断耐药结核病的对照性分析

王小路 梅 敏 刘光初 胡群芳 史安良 雷建平 熊国亮

结核病在临床上较为常见，是一种多发传染性疾病，会给人类身心健康和生命安全造成不利影响[1]。特点是耐多药结核病的出现，会增加治疗难度，提升病死率[2-3]。当前，临床上对耐药结核病的研究不断深入，认为结核分枝杆菌药物作用靶点基因点突变在耐药结核病发生中发挥着重要的作用[4]。而临床上采取积极措施进行结核分枝杆菌及药物敏感性检测，能指导耐药结核病早期诊断和治疗。以往，临床上多采用液体快速培养技术检测结核分枝杆菌及耐药性，但也具有检测时间长等弊端，应用有限[5]。故需寻找更为快速、有效、敏感的结核分枝杆菌及耐药检测技术，以指导临床治疗方案制定，改善患者预后。近年来，人们开始越来越多地关注基因芯片技术在耐药结核病诊断中的应用，认为其能有效检测常用抗痨药物敏感性[6-7]。但临床上针对耐药结核病诊断中基因芯片技术应用的研究仍较少，且大多不够深入。本次研究重点对比分析了耐药结核病诊断中基因芯片、液体快速培养技术的应用效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

所选研究对象为2016年4月—2017年4月本院结核病科收治的100例结核病患者。纳入标准：①慢性排菌或复治失败；②初治失败；③痰涂片阳性；④资料完整。排除标准：①资料不完整；②耐药检测失败。本组患者中，男78例，女22例；年龄18～70岁，平均年龄(56.15±5.40)岁，其中16例为18～39岁，32例为40～59岁，52例为60～70岁。本次研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 所用仪器包括BioHermes公司生产的结核分枝杆菌罗氏培养基、Jouan公司生产的离心机、BD公司的结核培养仪BACTEC MGIT-960、康圣环球医学技术有限公司的基因芯片阅读仪、北京博奥生物有限公司Slide Washer TM8芯片洗干仪及BioMixerTMⅡ芯片杂交仪、Bio-Rad公司的核酸电泳槽及电泳仪等。所用试剂包括康圣环球医学技术有限公司生产的结核分枝杆菌耐药突变基因试剂盒、上海生工生物工程股份有限公司的琼脂糖、溴化乙锭等。

1.2.2 留取痰液标本 指导患者留取脓性粘液样、干酪样或脓样痰液，痰液样本在室温下放置时间<24 h，2～8℃环境下保存时间<1周。

1.2.3 液体快速培养技术 根据《分枝杆菌分离培养标准化操作规程及质量保证手册》[8]16-34处理结核菌培养标本，并进行培养。步骤：取10 mL痰液，置于50 mL离心管，准确标记；加入<10 mL等量2% NALC-NaOH前处理液，漩涡振荡，持续20 s；室温下静置15 min；加入无菌PBS液，直至达到50 mL，离心3 000 g，持续15 min，取上清液；加入PBS液1～3 mL，中和PH，直至达6.8；标本处理后，接种到培养管实施液体培养。

1.2.4 药敏试验 液体快速培养法分离的阳性菌株，根据《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[8]15-28，通过微孔板比例法，分别与一线药物利福平、异烟肼进行药敏试验。

1.2.5 基因芯片法 根据结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒说明书提取痰样DNA，并进行PCR扩增、杂交、芯片处理及结果评估等。步骤：①取痰样DNA：取1 mL痰样，加入等量4% NaOH液化，13 000 r/min离心，持续5 min，弃上清液，取沉淀；以1 mL M洗液加入沉淀，混匀，10 000 r/min离心，持续2 min，弃上清液；以50 μL,裂解液加入沉淀，混匀，沸水处理10 min，10 000 r/min离心，持续2 min，取上清液。②PCR扩增：取标记好的PCR反应管，5 000 rpm离心，持续2 s，加入4 μL已提取待测样品DNA。取两个PCR反应管，分别加入M阴性、阳性质控品DNA。扩增条件：50℃条件下持续2 min，95℃条件下持续10 min，95℃条件下持续45 s，共20 cycles循环数；64℃条件下持续60 s，95℃条件下持续30 s，56℃条件下持续30 s，共30 cycles循环数；68℃条件下持续45 s，68℃条件下持续5 min。③杂交：将标有患者编号的膜条置入15 mL塑料离心管，加5～6 mL AT液、25 μg PCR产物，混匀；沸水加热10 min；离心管置入分子杂交箱，59℃条件下持续1.5 h；取50 mL塑料管，以40 mL B液加入，在分子杂交箱中预热，直至59 ℃。同步处理阴性与阳性质控品。④洗膜：膜条取出，转移到预热至59℃的B液塑料管中，轻摇洗涤，持续15 min；根据2 000∶1比例处理AT液、POD，配置孵育液，持续30 min；弃POD液；室温下AT液轻摇2次，15 min/次；室温下，C液洗膜，持续2 min；配置显色液，置入膜条，避光显色，持续5～10 min，观察结果。经由检测利福平、异烟肼位点突变情况分析其耐药型。基因芯片探针可检测利福平耐药相关基因rpoB 6个位点突变(S531W、D516G、D516V、H526D、S531L、H526Y)及异烟肼耐药相关基因katG 315位密码子等。检测耐药基因为野生型，即为相应药物敏感；检测耐药基因为突变型，即为相应药物耐药。

1.3 观察指标

①以液体快速培养技术为金标准，判断基因芯片诊断结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。其中，敏感度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100.0%；特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100.0%；阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100.0%；阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)×100.0%。②以药敏试验结果为金标准，判断基因芯片诊断结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的耐药检出情况。

1.4 统计学分析

以SPSS 20.0统计学软件分析数据资料。患者性别、特异度、敏感度等计数资料用2检验。患者年龄等计量资料以表示，以t检验。不同方法检测结果一致性采用Kappa检验，Kappa值<0.4为一致性较差，0.4≤Kappa值<0.75为一致性较好，Kappa值≥0.75为一致性较高。P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 基因芯片法与液体快速培养法检测结核分枝杆菌结果

以液体快速培养法为标准，基因芯片检测结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为81.67%(49/60)、95.00%(38/40)、96.08%(49/51)、77.55%(38/49)。Kappa检验显示两者一致性较高(Kappa值=0.77)。

2.2 基因芯片法与液体快速培养法对结核分枝杆菌阳性检出率对比

基因芯片法、液体快速培养法检测整体阳性率分别为50.00%(50/100)、58.00%(58/100)，差异无统计学意义(2=1.288，P=0.256)。

2.3 基因芯片检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药性

本组100例痰标本经液体快速培养技术，结果显示结核分枝杆菌菌株阳性58例，均实施药敏试验。以58例标本药敏试验检测利福平、异烟肼耐药结果为标准，基因芯片法检测利福平耐药敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为77.78%、97.96%、87.50%、96.00%，Kappa检验显示两者一致性较高(Kappa值=0.79)；基因芯片检测异烟肼耐药敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为80.00%、100.00%、100.00%、96.00%，Kappa检验显示两者一致性较高(Kappa值=0.82)。见表1。

表1 基因芯片检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药性分析 (n，%)

3 讨论

作为临床上一种常见慢性感染性疾病，结核病主要由结核分枝杆菌感染造成，临床特征为干酪样坏死、肉芽组织增生，极易累及人体多个器官，其中最常见为肺组织[9]。结核病又被称为“痨病”、“白色瘟疫”等，发病历史悠久，且病死率高。直至人类发现结核分枝杆菌在结核病发生中的作用，才开始进行有效结核病防治[10-11]。特别是近年来，随着利福平、异烟肼抗结核化疗药物的应用，结核病病情明显得到控制。但受国内人口数量增多、人口流动、人类免疫缺陷病毒感染等因素影响，结核病疫情仍然较为严重。特别是近年来，耐药性结核病发病人数不断增多，治疗难度大，病死率高。故需深入分析结核分枝杆菌耐药机制及特点，寻找快速、准确的方法检测结核分枝杆菌，以指导早期诊断和治疗，合理控制疫情。

当前，临床上检测结核分枝杆菌耐药的方法较多，包括DNA直接测序技术、聚合酶联反应-单链构象多态性分析、基因芯片、培养法等。其中，DNA直接测序技术在某些结核分枝杆菌耐药性基因突变诊断中有重要作用，但也具有价格昂贵等弊端[12]。聚合酶链反应-单链构象多态性分析无需特殊仪器、试剂，技术条件较为成熟，且不会导致出现放射性污染，检测阳性率高[13]。但检测过程中也极易受检测DNA片段长度、胶浓度、缓冲液力度强度、电泳温度等因素影响，且仅适用于筛选基因突变，应用受限。液体培养法加药敏试验是结核病诊断金标准，但也具有耗时时间长、程序繁琐、重复性差等弊端，往往需要4～8周才能获得检测结果，影响结核病，特别是耐药结核病的早期诊断和治疗[14]。近年来，人们开始越来越多地关注基因芯片法在结核病诊断中的应用，该方法是在玻璃等固相载体上，以高密度方式固定生物信息分子，将待测样本的DNA或RNA与探针杂交，通过特定仪器显色及扫描，量化分析杂交结果，从而获得检测信息[15-17]。在分子突变检测中，基因芯片技术不仅能对突变位点、突变类型进行明确，还能同时检测多个基因甚至整个基因组的突变，且具有特异度高等特点。近年来，随着临床上对结核分枝杆菌耐药相关基因及突变位点研究的不断深入，结核分枝杆菌耐药检测中基因芯片技术的应用开始引起人们的高度关注。陈蕾[18]调查发现，结核病诊断中基因芯片法应用价值较高，能快速检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药的常见突变位点，且能对非结核分枝杆菌属进行鉴别诊断。

本次研究以液体快速培养法为标准，判断基因芯片法检测结核分枝杆菌的效果。结果发现，以液体快速培养法为标准时，基因芯片检测结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为81.67%、95.00%、96.08%、77.55%，具有较高一致性。但本研究结果与董永康等[19]调查的敏感度92.3%、特异度100.00%存在偏差，考虑与标准选择不同、标本类型及质量等因素有关。本次研究所选标本类型均为痰液标本，细菌数量可能较纤维支气管镜冲洗液低，故今后仍需加大研究力度，联合应用痰标本和纤维支气管镜标本进行检测。基因芯片法检测结核分枝杆菌整体阳性率为50.00%，液体快速培养法则为58.00%，漏检原因可能与实验人员过早判读菌落生长结果、受试菌株生长状态等有关。此外，本次研究还重点分析了基因芯片法检测利福平、异烟肼耐药性。黄海滨等[20]调查发现，基因芯片技术能有效检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药情况，且便于判断katG、inhA、oxyR-ahpC以及rpoB基因突变位置。本次研究以药敏试验为标准，发现基因芯片法检测利福平、异烟肼的耐药敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为77.78%、97.96%、87.50%、96.00%和80.00%、100.00%、100.00%、96.00%，Kappa检验显示一致性较高。陈林等[21]调查分析了结核病耐多药快速检测中基因芯片技术的应用效果，并对比罗氏培养法，发现基因芯片技术对异烟肼耐药检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为80.2%、95.9%、71.8%、97.4%，对利福平耐药检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.42%、97.5%、80.9%、98.3%。从中可以发现，本次研究利福平耐药敏感度、阳性预测值较陈林等人报道低，且异烟肼耐药特异度、阳性预测值较其报道高。笔者认为，这一差异可能与该研究痰涂阳肺结核增加耐药表型敏感度等因素有关。总体来说，基因芯片对利福平、异烟肼耐药检测的敏感度和特异度均较高，与药敏试验一致性较高，提示其具有良好应用价值。

综上所述，基因芯片法在结核病结核分枝杆菌检测及耐药性诊断中具有较高应用价值，需引起高度关注。