姜黄挥发油对禽致病性大肠杆菌的药敏试验

潘百明 ， 何彩梅 ， 梁昌祥 ， 韦学丰 ， 周慧玲

(贺州学院食品与生物工程学院 ， 广西贺州542899)

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌引起的一种传染病，该病存在于世界各地的家禽中，引起心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、大肠杆菌性肉芽肿和脐炎等病变，严重时会导致发病家禽出现败血症和死亡；禽致病性大肠杆菌存在多种血清型，对多种抗生素、磺胺类和呋喃类药物都敏感，但极易产生耐药性。本文在10个集约化养鸡场分离出10个禽致病性大肠杆菌菌株，选用6种较为敏感(近期曾做过试验)的抗生素做对照，用姜黄挥发油做药敏试验，寻找中药防治禽大肠杆菌病的方法。

姜黄别名毛姜黄、郁金，为姜科多年生草本植物；姜黄最主要的两个活性成分为姜黄素及姜黄挥发油，是一种可以药食两用的植物香料[1]，据国内外的相关研究报告，姜黄挥发油对致病性菌均有一定的抑菌活性[2]，对大肠杆菌等具有抗菌活性，对金黄色葡萄球菌等作用较为明显[3]。本试验采用超声波辅助提取法提取姜黄挥发油，对病禽分离出来的致病性大肠杆菌进行药敏试验，为有效防治禽大肠杆菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 姜黄片 购自贺州学院东区后门旁的瑞康药店，产地为广西，由安徽人民中药饮片有限公司生产。

1.1.2 试验菌 由贺州学院微生物学实验室分别从10个不同乡镇集约化养鸡场病鸡分离，根据病理变化、镜检、细菌培养特性和生理生化试验，鉴定为致病性大肠杆菌。

1.1.3 药敏试纸 杭州天和微生物试剂有限公司的药敏纸片。

1.1.4 主要仪器 超声波仪(JY98-3D)：宁波新艺生物科技股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-100SⅡ)：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；循环水式多用真空泵(SHZ—DⅢ)：河南省予华仪器有限公司；电子分析天平(FA2004)：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热培养箱恒温(DHP-9082)：上海齐欣科学仪器有限公司；双人双面净化工作台(SW-CJ-2F)：苏州净化设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黄挥发油的提取 参照宋曰钦[4]等的提取方法提取姜黄挥发油，将姜黄片于粉碎机粉碎后，分别称取3份30 g的姜黄粉末过30目的标准筛后置于洗净干燥的三角瓶中，按1∶10的比例分别量取300 mL的石油醚于瓶里，分别放在超声波清洗器里，设置温度为20 ℃～30 ℃，功率为100 w，时间为30 min；经过超声波处理后，抽滤，将滤液放在圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪来浓缩滤液，温度控制在60 ℃，直至冷凝管无液体滴落，产品在蒸馏瓶里，收集瓶里回收石油醚；将蒸馏瓶倒置在洗净干燥后的小烧杯里，里面的油会缓慢流下来，静置30 min，将3次所收集的挥发油混合放一起得到橙黄色的油状的液体，避光保存备用。经测定姜黄挥发油的含量为7%。

1.2.2 姜黄挥发油的配制 将以上的挥发油用1%吐温-80水溶液溶解并配制姜黄挥发油溶液的浓度为200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL的溶液。

1.2.3 药敏试验

1.2.3.1 姜黄挥发油抑菌浓度的选择 取自病鸡分离出来的大肠杆菌菌株，在无菌操作下于营养琼脂平板以划线方式将细菌均匀涂布到整个平板上；将牛津杯轻轻地放在平板上，将姜黄挥发油溶液慢慢倒入牛津杯，不可溢出，每个平板上放3个牛津杯，将各个浓度梯度做好标记，放置于恒温培养箱37 ℃，培养24 h。

1.2.3.2 姜黄挥发油对10个菌株的药敏试验 选用平时做过药敏试验较为敏感的环丙沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、氟本尼考、多西环素、头孢噻肟等6种抗生素和姜黄挥发油对10个不同大肠杆菌菌株做药敏试验，6种抗生素按药敏纸片法做药敏试验，培养基为普通营养琼脂；姜黄挥发油采用牛津杯法做药敏试验，选择(1.2.3.1试验)最佳浓度为25 mg/mL的姜黄药物浓度，判断标准见表1。

表1 药敏实验判定标准

2 结果与分析

2.1 姜黄挥发油抑菌浓度 见表2。

表2 姜黄挥发油在不同的浓度下的抑菌情况

由表2可知，25 mg/mL姜黄挥发油浓度抑菌效果已达到高敏，大于此浓度的50 mg/mL、100 mg/mL和200 mg/mL 3个浓度均为高敏，因此在使用姜黄挥发油防治大肠杆菌病时并不是浓度越高越好，本试验只设定200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL 6个姜黄挥发油浓度，试验结果25 mg/mL浓度为最低抑菌(高敏)浓度，超过该浓度反而造成药物浪费；小于该浓度的对大肠杆菌病达不到治疗效果。

2.2 姜黄挥发油(25 mg/ /mL)对10株大肠杆菌的药敏结果 见表3。

表3 姜黄挥发油及6种抗生素对10株大肠杆菌的药敏结果

从表3可以看到，10株大肠杆菌对姜黄挥发油均敏感，其中9株达到高敏；而6种抗生素有3种存在不同程度的耐药性，这3种抗生素口服用药比较方便，市场比较普遍，这可能在场内常用导致；较敏感的3种抗生素中，敏感性也存在差异，其中头孢噻肟有产生耐药的趋势，如果长期使用会产生耐药性。

3 讨论

本试验结果表明，姜黄挥发油对致病性禽大肠杆菌具有高度的敏感性，可以用于预防和治疗禽大肠杆菌病；姜黄挥发油浓度为25 mg/mL，抑菌圈最大，抑菌作用较好，具有抑杀禽大肠杆菌的作用；可长期用作大肠杆菌病的治疗药物和预防保健药物；由于大肠杆菌存在多种血清型，极易产生耐药性，开发姜黄药剂对于预防和治疗禽大肠杆菌病有很重要的意义；集约化养鸡场可以尝试姜黄与抗生素配合使用，减少耐药性的产生，也可以用姜黄粉碎拌入饲料进行预防，减少和预防禽大肠杆菌病的发生。