河南省种鸡场鸡白痢沙门菌的耐药性分析

徐耀辉 ， 齐亚如 ， 周俊豪 ， 王明瑜 ， 陈 益 ， 蒋增海 ， 邓同炜 ， 李文刚

(河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南郑州450046)

鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种重要的禽类传染病，可造成幼雏大量死亡、产蛋鸡产蛋下降、种蛋孵化率降低，弱雏率增加。沙门菌既可经饮水、饲料甚至媒介生物水平传播，也可经受精卵垂直传播[1]。我国对鸡沙门菌病非常重视，将其列为16种优先防治的动物疫病之一。《国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020年)》提出， 2020年全国所有种鸡场沙门菌病达到净化标准。由于至今仍没有一个理想的疫苗上市，并且严格的生物安全措施在相当数量的养殖场难以实现，为防治包括沙门菌病在内的细菌性疾病，抗菌药物在临床上仍广泛应用甚至滥用，使得动物源细菌的耐药性逐渐增强，对养殖场细菌性疾病的防控乃至公共卫生受到了严重挑战。目前，关于河南省鸡白痢沙门菌耐药状况的报道资料较少。本试验对2014年7月-2015年8月分离自河南省6个地区12个鸡场的395株鸡白痢沙门菌进行耐药表型及耐药基因检测，以了解沙门菌耐药状况及耐药规律，为进一步了解耐药产生机制，指导科学使用药物、防控鸡沙门菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 2×TaqMaster Mix、DNA Marker DL-2 000，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；MH琼脂及药敏纸片，购自英国Oxoid公司；麦氏比浊管，购自广东环凯微生物科技有限公司。扩增耐药基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 试验菌株 标准菌株大肠杆菌ATCC25922由江苏省人兽共患病学重点实验室惠赠；395株鸡白痢沙门菌均为2014-2015年分离自河南省6个地区共12个种鸡场自带孵化场的死胚样品。郑州地区6个场(ZZ1、ZZ2、ZZ3、ZZ4、ZZ5、ZZ6)；许昌地区1个场(XC1)；商丘地区1个场(SQ1)；平顶山地区1个场( PDS1)；漯河地区2个场(LH1、LH2)；信阳地区1个场(XY1)。分离菌株由河南牧业经济学院兽医传染病实验室保存。

1.3 药敏纸片 试验所用20种药敏片均为英国Oxoid公司产品，详见表1；ESBLs初筛及确证试验所用药敏纸片头孢他啶(CAZ，30 μg/片)、头孢他啶/克拉维酸(3∶1) (CAZ/CA，30/10 μg/片)、头孢噻肟(CTX，30 μg/片)、头孢噻肟/克拉维酸(3∶1)(CTX/CA，30/10 μg/片)，均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.4 药敏试验及ESBLs确证试验 按照K-B法和美国临床实验室标准化协会(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)手册[2]进行抗菌药物的敏感性试验和产ESBLs菌的筛选及确证试验。以E.coli(ATCC25922)为质控菌株，试验结果按照手册[2]要求进行判读。

1.5 耐药基因的PCR检测 根据耐药表型不同，扩增相应的37种耐药基因。超广谱β-内酰胺酶类(Extended-Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)12种：TEM，SHV，CTX-M-1，CTX-M-2，CTX-M-3，CTX-M-8，CTX-M-9，CTX-M-25，OXA-1，OXA-2，OXA-10，PSE；氨基糖苷类10种：armA，rmtA，rmtB，rmtC，rmtD，rmtE，npmA，aac(3)-IV，aac6'-Ib，aadA1-like；头孢菌素类6种：MOX，CIT，DHA，ACC，EBC，FOX；磺胺类3种：sul1，sul2，sul3；四环素类6种：tetA，tetG，tetX，tetB，tetC，tetR。引物设计及反应条件见参考文献[3]，扩增后随机选取扩增产物进行测序和序列比较。

2 结果

2.1 鸡白痢沙门菌药敏试验结果 分离株对磺胺异噁唑耐药率最高(74.18%)，对氨苄西林(50.89%)、四环素(44.56%)、土霉素(43.05%)3种药物耐药率较高，对15种抗菌药的耐药率均在7%以下，其中对多粘菌素E、美罗培南、亚胺培南全为敏感。尽管分离菌株对环丙沙星的耐药率不高(1.27%)，但有较大比例(88.19%)的菌株表现为中介。详细结果见表1。经ESBLs初筛和确证试验，有2株分离菌株产ESBLs。

2.2 鸡白痢沙门菌耐药性的鸡场分布 在检测的12个鸡场中，所有鸡场均能检测到耐磺胺异噁唑的菌株，11个鸡场检测到耐四环素、土霉素的菌株，9个鸡场检测到对氨苄西林耐药的菌株，8个场检测到耐磺胺甲噁唑/甲氧苄啶药的菌株，7个场检测到耐头孢唑啉的菌株。出现对环丙沙星(3个)、头孢曲松(3个)、呋喃妥因(3个)、氯霉素(1个)、恩诺沙星(1个)耐药菌株的鸡场数量较少。菌株耐药率在各个场之间差异较大，比如， ZZ6、XC1、SQ1分离菌株耐氨苄西林严重(耐药率超过90%)，而其他场菌株耐药率较低或不耐药。ZZ1、ZZ3、ZZ5、ZZ6场菌株对四环素、土霉素耐药严重(耐药率超过65%)；对于磺胺甲噁唑/甲氧苄啶，ZZ1、ZZ3、ZZ5场菌株耐药率均超过65%，而有8个场分离菌株耐药率低于10%。

2.3 不同场区来源的鸡白痢沙门菌耐药谱比较 郑州地区6个场来源菌株除了ZZ6场较为复杂，主要耐药谱为青霉素类-四环素类-磺胺类(56.38%)外，其余5个场分离菌株主要耐药谱均为四环素类-磺胺类；其余5个地区的6个鸡场分离株主要耐药谱均为青霉素类-磺胺类，其中SQ1场出现最广泛耐药谱，可耐8类14种抗生素。

2.4 鸡白痢沙门菌耐药谱检测结果 鸡白痢沙门菌3重以上耐药的有110株，占27.84%，以3重耐药的青霉素类-四环素类-磺胺类耐药谱型比例最高，占19.49%，最高可出现8重耐药。详见表2。

表1 药敏纸片种类与检测结果

表2 鸡白痢沙门菌多重耐药谱

2.5 鸡白痢沙门菌耐药基因的检测结果 共检测出12种耐药基因；2株产ESBLs菌株均检测到TEM 1种耐药基因；8株耐氨基糖苷类的菌株检测到aac(3)-IV、aadA1-like 2种耐药基因；27株耐头孢菌素类的菌株检出MOX、ACC、DHA、CIT四种耐药基因；294株耐磺胺类菌株检出sul1、sul2、sul3三种耐药基因；177株耐四环素类的菌株共检出tetA、tetR两种耐药基因，tetA为优势耐药基因；各种耐药基因的检出率见图1。

2.6 鸡白痢沙门菌耐药基因型的检测结果 本研究中5类耐药表型的菌株均可检出一种或多种相关耐药基因，且耐药表型和基因型的符合率均在83%以上，见表3。

图112种耐药基因的检出情况

表3 鸡白痢沙门菌耐药基因型的分析结果

3 讨论

本试验对河南省新近分离的395株鸡白痢沙门菌进行20种抗菌药物的耐药性检测，结果表明，分离菌株耐药率超过40%的有4种，分别是磺胺异噁唑(74.18%)、氨苄西林(50.89%)、四环素(44.56%)、土霉素(43.05%)，这与邹明等[4]、王德宁等[5]、孙瑜[6]、刘新静[7]报道的北京、陕西、哈尔滨、河北等地区的鸡源性沙门菌耐药情况基本一致。这些人兽共用药物长期被广泛用于我国的畜禽养殖中，药物的选择压力使细菌产生了相当高的耐药性，临床上应减少或暂停使用，避免耐药基因在人类和动物病原菌间传播，进而通过食物链对公共卫生造成威胁。

本试验的395株鸡白痢沙门菌对氨基糖苷类药物耐药率(小于3%)明显低于王德宁[5]和孙瑜[6]的报道，可能是氨基糖苷类药物在涉及的养殖场使用较少。本试验所有菌株对兽医禁用的美罗培南、亚胺培南、多黏菌素E均不耐药，对氯霉素(1.01%)、呋喃妥因(1.52%)耐药率较低，表明加强兽药管理可以有效减少细菌耐药性的产生。β内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)能与产酶菌产生的β内酰胺酶发生不可逆结合而使其失去水解抗生素的能力，本试验中，当阿莫西林与酶抑制剂联用后，它们的抗菌活性显著增强，产酶菌耐药率显著下降(从对氨苄西林的耐药率50.89%到对阿莫西林-克拉维酸的耐药率0.25%)，表明在控制产酶耐药菌感染方面，β内酰胺类与酶抑制剂联用可能是一种有效方法。

本试验中菌株对磺胺异噁唑的耐药率达到74.18%，而对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药率为17.97%，表明加入增效剂后可明显增强抗菌药物的抑菌效果。菌株对氟喹诺酮类药耐药率虽较低，但表现中介的比例较高，尤其是环丙沙星的中介率高达88.19%，预示着中介菌株转化为耐药菌株的风险较大[8]，提示我们生产中要科学合理使用。

本试验中，来源于相同地区的菌株耐药谱较为相似，部分鸡场的主要耐药表型呈现一致。如郑州地区的6个场中有5个场存在一个主要的耐药表型：耐四环素类-磺胺类，另外1个场(ZZ6)不同。其他5个地区的6个场分离菌株耐药谱主要为耐青霉素类-磺胺类，SQ1场菌株耐青霉素类-四环素类-磺胺类也有较高比例(32.76%)。不同地区的菌株可能有相似或相近的耐药谱[9-10]，不同场区之间沙门菌的耐药性可能与用药习惯紧密相关。

本试验中27株耐头孢类的菌株共检出MOX(66.67%)、DHA(51.85)、ACC(81.48%)、CIT(0.37%)四种耐药基因，与匡秀华[11]报道的DHA(14.97%)、CIT(2.14%)检测结果不一致；177株耐四环素类的菌株共检出tetA (82.49%)、tetR(8.47%)两种耐药基因，与戴建华等[12]报道的禽源沙门菌耐药基因tetA (59.09%)、tetB(50%)、tetC(68.18%)的检测结果不一致；294株耐磺胺类菌株共检出sul1(22.11%)、sul2(68.71%)、sul3(49.66%)三种磺胺类耐药基因，与薛原等[13]报道的鸡源沙门菌耐药基因sul1(100%)、sul2(68.6%)、sul3(94.3%)的检测结果不一致；表明在沙门菌产生耐药性过程中不同耐药基因的参与程度存在差异。另外，少部分具有耐药表型的菌株没有检测到本文所列的耐药基因，表明耐药机制较为复杂，有待于进一步研究。