Dnmt1和GnRH在母羊初情期启动过程中下丘脑的分布定位

宫永胜 ， 丁 赫 ， 吕文发 ， 王 军

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118)

初情期是动物获得繁殖能力的标志，其启动时间关系到动物的性成熟和繁殖性能，初情期启动过程极其复杂，其机制尚未完全阐明。现已明确，下丘脑促性腺激素细胞以脉冲式分泌GnRH，其作用于垂体上促腺激素释放激素受体(GnRH-R)，诱发促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)峰值引起母畜的初情期启动[1-2]。研究表明，初情期启动伴随着转录抑制因子的DNA甲基化与组蛋白修饰的变化，从而激活相关基因参与初情期启动[3-4]。Dnmt1作为DNA甲基转移酶维持着基因的甲基化，在DNA复制过程中，Dnmt1按照亲本DNA的链来修复子链的特异甲基化模式[5]，调控相关基因的表达。

GnRH神经元胞体主要存在下丘脑中的视前区和弓状核[4]，DNA甲基化参与初情期启动，初情期启动过程中下丘脑 Dnmt1与GnRH的关系尚不清楚。本试验通过免疫荧光双标记技术研究Dnmt1和GnRH在母羊下丘脑中POA和ARC核团的分布及两者的关系，研究结果不仅可明确母羊初情期启动过程中Dnmt1和GnRH的分布规律，而且也为DNA甲基化调控母羊初情机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品 采集初情期启动不同阶段(初情期前，临近初情期，初情期)母羊的下丘脑组织，下丘脑前端止于视交叉，后端止于乳头体，置于4%多聚甲醛中固定48 h，转入20%蔗糖PBS进行脱水，待其组织完全沉浸于溶液中，用OCT包埋剂对组织进行包埋，制作下丘脑组织冰冻切片，切片厚度25 μm，用于免疫荧光双标记试验。

1.2 药品和试剂 OCT包埋剂、冰冻切片快速抗原修复液、免疫染色封闭液和含抗荧光淬灭封片液等试剂，购自碧云天生物技术有限公司；GnRH(ab5617)和Dnmt1抗体(OAEB01589)抗体，购自AVIVA 生物有限公司；及相应免疫荧光二抗，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 免疫荧光试验 利用冰冻切片快速抗原修复液对组织切片进行修复，TBST洗片5 min，用4%多聚甲醛进行固定、洗片，组织上滴加免疫染色封闭液，湿盒中37 ℃封闭1 h，以减少非特异性染色；弃去封闭液滴加GnRH一抗(稀释比例为1∶500)，湿盒中4 ℃孵育过夜，擦干后滴加对应的GnRH荧光二抗(稀释比例为1∶200)，37 ℃孵育1 h；洗净后滴加Dnmt1一抗(稀释比例为1∶300)，4 ℃孵育过夜后，滴加对应的Dnmt1荧光二抗(稀释比例为1∶60)，同时对组织进行复核染，滴加DAPI(工作液浓度1 μg/mL)室温孵育5 min，用含抗荧光淬灭剂的封片液进行封片，激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像。

1.4 数据处理 通过Olympus激光共聚焦显微镜配套ZEN软件分析免疫荧光图片并统计阳性细胞数量。应用SPSS 18.0统计软件进行方差分析，用Duncan′s法进行多重比较确定各组之间的差异显著性，以P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 Dnmt1和GnRH在下丘脑中POA的表达和分布 如图1所示，在母羊下丘脑中POA均有Dnmt1和GnRH表达，且呈现共表达模式。阳性细胞数变化如图2，初情期前期和临近初情期下丘脑阳性细胞数差异不显著(P>0.05)，初情期阳性细胞数显著低于初情期前期和临近初情期(P<0.05)。

2.2 Dnmt1和GnRH在下丘脑中ARC的表达和分布 如中插彩版图3所示，在下丘脑ARC核团中均有Dnmt1和GnRH表达，且两者呈现共表达模式。阳性细胞数变化如图4，初情期前期和临近初情期阳性细胞数差异不显著(P>0.05),初情期阳性细胞数显著高于初情期前期和临近初情期(P<0.05)

图2 Dnmt1与GnRH共表达阳性细胞数统计

*：差异显著(P<0.05)

图4 母羊初情期启动过程中弓状核Dnmt1与GnRH共表达阳性细胞数统计

*：差异显著(P<0.05)

3 讨论

初情期启动受下丘脑中枢调控，下丘脑分泌GnRH作用于垂体前叶，使其分泌促性腺激素刺激卵泡发育，性腺类固醇激素也可反馈到下丘脑控制GnRH分泌[6]。现已明确，下丘脑中视前区和弓状核是GnRH分布的主要核团，也是GnRH接受雌激素反馈的重要位点[7]。现有研究表明，DNA甲基化作用可调节下丘脑初情期启动关键基因的表达[6]。Dnmt1作为DNA甲基转移酶负责新合成的DNA单链和半甲基化DNA链维持在5-mc模式[5]，其在初情期启动过程中的作用尚不清楚。本试验首次发现Dnmt1在下丘脑POA和ARC均有表达，主要分布于母羊下丘脑ARC，其与GnRH存在明显的共表达，且初情期启动时其共表达阳性细胞数量显著增多。

本试验结果表明，GnRH在初情期启动过程中主要分布在下丘脑POA和ARC部位，这与以往研究结果一致。刘宵等发现，母羊出生后下丘脑各核团GnRH细胞数量随月龄增长而增多[8]。Marta Wan′kowska等发现，在母羊初情期时POA中GnRH胞体数量减少[7]。目前有关Dnmt1在初情期启动过程中的表达分布还鲜有报道，本研究发现，随着初情期启动，Dnmt1在母羊下丘脑的POA和ARC均有表达。本试验还发现Dnmt1和GnRH在ARC和POA呈现共表达模式，且共表达水平在初情期启动时最高，这提示Dnmt1可能通过调节GnRH表达量而参与母羊初情期启动。现有研究表明，Roth CL等发现恒河猴初情期启动时伴随着Dnmt1表达量的下降[9]。Kurian J R等研究表明，恒河猴初情期GnRH启动子区DNA甲基化水平降低[10-11]。

本研究仅通过免疫荧光标记技术检测Dnmt1和GnRH在下丘脑ARC和POA存在共表达模式，尚不能明确其作用的分子机制，有待于进一步研究探索。