三七总皂苷与淫羊藿总黄酮联合对自然衰老大鼠睾丸生殖功能衰退的影响

杜丽娜 王超 王芳

摘要：目的 观察三七总皂苷（PNS）与淫羊藿总黄酮（TFE）联合对自然衰老大鼠睾丸生殖功能衰退的影响，探讨其作用机制。方法 将30只18月龄SD大鼠随机分为自然衰老组和PNS+TFE低、高剂量组，每组10只。另取10只2月龄大鼠为青年对照组。PNS+TFE低、高剂量组大鼠分别给予10 mg/kg PNS、TFE和20 mg/kg PNS、TFE灌胃，自然衰老组和青年对照组大鼠给予生理盐水灌胃。每周连续给药6 d，共4个月。末次给药后24 h，大鼠称重后处死，取睾丸组织，称取质量，计算睾丸指数。HE染色观察睾丸组织形态，TUNEL法检测大鼠生殖细胞凋亡，Western blot检测睾丸组织抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和DNA损伤蛋白γ-H2AX的表达。结果 与自然衰老组比较，PNS+TFE低、高剂量组衰老大鼠睾丸质量和睾丸指数均明显升高，生精小管组织形态明显改善，睾丸生精细胞凋亡数量明显减少，睾丸组织Bcl-2蛋白表达显著上调，Bax和γ-H2AX蛋白表达显著下调，Bax/Bcl-2比值降低。结论 PNS与TFE联合给药可延缓自然衰老大鼠生殖功能衰退，其机制可能与抑制睾丸生殖细胞的凋亡和DNA损伤有关。

关键词：三七总皂苷；淫羊藿总黄酮；衰老；凋亡；DNA损伤；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.008

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0031-04

Abstract： Objective To investigate the effects of panax notoginseng saponins （PNS） combined with total flavonoids from epimedium （TFE） on testicular dysfunction in natural aging rats； To discuss its mechanism of action. Methods Thirty 18-month old male SD rats were randomly divided into natural aging group， PNS combined with TFE low and high dose groups， with 10 rats in each group. Another 10 2-month old rats were set as young control group. PNS combined with TFE low and high dose groups were given gastric gavage of 10 mg/kg PNS combined with 10 mg/kg TFE， and 20 mg/kg PNS combined with 20 mg/kg TFE， respectively. Rats in young control group and natural aging group were given saline for 6 d each week， lasting for 4 months. Then， rats were sacrificed， and the testes were obtained to calculate the testicular weight and the testicular index. The testicular tissue morphology was observed by using HE staining. Testicular germ cell apoptosis was detected by using TUNEL method. The levels of Bcl-2， Bax and γ-H2AX protein expression in testicular tissue were detected by Western blot. Results Compared with natural aging group， low and high dose of PNS combined with TFE significantly elevated the testicular weight and testicular index， improved the histological changes of testicular seminiferous tubule， significantly reduced number of apoptosis of spermatogenic cells in the testis， upregulated the expression of Bcl-2 protein in the testis， downregulated the expression of Bax and γ-H2AX protein， and decreased the ratio of Bax/Bcl-2. Conclusion PNS combined with TFE can improve testicular dysfunction in natural aging rats by inhibiting apoptosis and DNA damage of germ cells.

Keywords： panax notoginseng saponins； total flavonoids from epimedium； aging； apoptosis； DNA damage； rats

三七為五加科人参属植物，其根茎入药。现代药理研究显示，三七有延缓衰老和保护生精功能等作用[1]，其中三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是三七的主要活性成分。淫羊藿是我国传统的补肾壮阳中药，以单味或复方入药，应用于性功能低下及睾丸病变，有补肾阳、抗睾丸衰老的功效，其中淫羊藿总黄酮（total flavonoids from epimedium，TFE）是淫羊藿的主要成分。现代药理研究显示，PNS有清除自由基、提高免疫力、拮抗睾丸炎症损伤、抑制细胞凋亡等作用[2]；TFE有增强性腺功能、延缓衰老、抗肿瘤等作用[3]。但二者联合给药是否可改善睾丸生殖功能衰退鲜有报道。因此，本实验以自然衰老大鼠为模型，观察PNS与TFE联合对自然衰老大鼠睾丸生殖功能衰退的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SD大鼠，2月龄10只，体质量（220±30）g，18月龄30只，体质量（500±50）g，均为SPF级，北京维利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于三峡大学医学院SPF级动物房，温度（23±3）℃，相对湿度（60±5）%，12 h明暗交替，自由摄食饮水。本实验遵循国家有关实验动物保护与使用的准则。

1.2 药物

PNS，成都植标化纯生物技术有限公司，纯度>95%；TFE，成都仁诚生物科技有限公司，质量分数80%。

1.3 主要试剂与仪器

β-Actin抗体（批号66009-1-lg），美国Proteintech公司；促凋亡蛋白Bax抗体（批号ab182733）、抗凋亡蛋白Bcl-2抗体（批号ab59348），美国Abcam公司；DNA损伤相关蛋白γ-H2AX抗体（批号SC-101696），美国Santa Cruz公司；二抗驴抗兔，美国Jackson Immuno Research公司；超敏ECL显影液，上海碧云天生物技术有限公司；TUNEL试剂盒，瑞士Roche公司；苯甲基黄酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制剂，武汉谷歌生物有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司。CS-V1型摊片烤片机，孝感市宏业医用仪器有限公司；1X53显微镜，日本Olympus公司；PowerPacTM Basic电泳仪、Mini Protean3 Cell电泳槽及蛋白电泳技术平台，美国Bio-Rad公司；Bioshine ChemiQ4800化学发光凝胶成像自动显影仪，上海欧翔科学仪器有限公司；Leica TP1020自动脱水机、Leica EG1150H石蜡包埋机、Leica EG1150C超薄切片机，德国Leica公司。

2 实验方法

2.1 分组及给药

将30只18月龄SD大鼠随机分为自然衰老组和PNS+TFE低、高剂量组（中药低、高剂量组），每组10只，另取10只2月龄大鼠为青年对照组。中药低剂量组予10 mg/kg PNS、TFE灌胃，中药高剂量组予20 mg/kg PNS、TFE灌胃，自然衰老组和青年对照组予生理盐水灌胃。给药体积均为1 mL/100 g，每周连续给药6 d，周日不给药，共4个月。末次给药24 h后，大鼠称重，麻醉处死，取出睾丸组织称重，计算睾丸指数[睾丸质量（mg）÷体质量（g）]。

2.2 HE染色

睾丸组织称重后，切取部分睾丸组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片（厚度5 μm），HE染色，中性树脂封片。光学显微镜下观察大鼠睾丸组织形态。

2.3 TUNEL法检测大鼠睾丸组织细胞凋亡

组织常规脱蜡，按照TUNEL试剂盒说明书操作，中性树脂封片，光学显微镜下观察大鼠睾丸组织细胞凋亡情况，棕黄色细胞即为凋亡细胞。

2.4 Western blot检测大鼠睾丸组织Bax、Bcl-2和γ-H2AX蛋白表达

称取所需睾丸组织50～100 mg置于1.5 mL EP管内，加入1 mL PBS，冰上充分剪碎，3500 r/min离心5 min，弃上清液，重复多次至上清液无色。按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制剂A∶蛋白磷酸酶抑制剂B为100∶1∶1∶1的比例加入350 μL裂解液裂解25 min。12 000 r/min离心10 min后取上清液，加入5×上样缓冲液，95 ℃煮沸10 min，使蛋白变性。等体积上样，SDS-PAGE凝胶电泳并恒流转PVDF膜后，5%脫脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。超敏ECL显影液A∶B=1∶1配制显影液，ECL化学发光显影，图像分析系统ImagePro Plus 6.0扫描其灰度值，GraphPad Prism软件进行数据分析。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。采用方差分析，组间比较用Dunnett't检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 三七总皂苷与淫羊藿总黄酮联合对自然衰老大鼠睾丸质量与睾丸指数的影响

与青年对照组比较，自然衰老组大鼠睾丸质量和睾丸指数显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与自然衰老组比较，中药低、高剂量组大鼠睾丸质量、睾丸指数显著上升，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.2 三七总皂苷与淫羊藿总黄酮联合对自然衰老大鼠睾丸组织形态学的影响

青年对照组大鼠睾丸组织生精小管上皮稍厚，生精小管内各层次细胞层数分明，排列紧密，核质分明，可见各级生精细胞；自然衰老组大鼠睾丸组织中生精小管上皮变薄，细胞数目较青年对照组明显减少，细胞层数明显减少，排列紊乱，各级生精细胞数目减少；与自然衰老组比较，中药低、高剂量组大鼠上述情况明显改善，睾丸组织生殖细胞层次和各级生精细胞呈剂量依赖性增加。结果见图1。

4.3 三七总皂苷与淫羊藿总黄酮联合对自然衰老大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响

与青年对照组比较，自然衰老组大鼠睾丸组织凋亡细胞数目明显增多，且主要表达于精原细胞和初级精母细胞；与自然衰老组比较，中药低、高剂量组大鼠睾丸组织凋亡细胞数量明显减少。结果见图2。

4.4 三七总皂苷与淫羊藿总黄酮联合对自然衰老大鼠睾丸组织Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

与青年对照组比较，自然衰老组大鼠睾丸组织Bax蛋白表达显著上调，Bcl-2蛋白表达显著下调，Bax/Bcl-2比值显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与自然衰老组比较，中药低、高剂量组大鼠睾丸组织Bax蛋白表达显著下调，Bcl-2蛋白表达显著上调，Bax/Bcl-2比值显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2、图3。

4.5 三七总皂苷与淫羊藿总黄酮联合对自然衰老大鼠睾丸组织DNA损伤相关蛋白γ-H2AX表达的影响

与青年对照组比较，自然衰老组大鼠睾丸组织γ-H2AX表达显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与自然衰老组比较，中药低、高剂量组γ-H2AX表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3、图4。

5 讨论

衰老是随年龄增长机体逐渐出现退行性变化的过程，表现为生物体内各部分器官系统功能的逐渐衰退。随着男性年龄的增加，精液参数及精子功能明显下降，妊娠等待时间明显延长。本实验结果显示，PNS和TFE联合给药后自然衰老大鼠的睾丸质量与睾丸指数显著升高，生精细胞层数和数目明显增加，各级生精细胞均有不同程度的恢复，提示PNS和TFE联合给药对自然衰老大鼠睾丸生殖功能衰退具有一定的保护作用。

细胞凋亡是细胞在基因控制下的程序化死亡，与衰老过程中器官功能的退化、衰老相关疾病的发展密切相关。有研究报道，衰老过程中逐渐增加的凋亡细胞会诱发雄性哺乳动物生精细胞凋亡增加，使精子数量减少，从而导致生殖功能减退[4]。本实验结果显示，PNS和TFE联合可明显降低衰老大鼠睾丸组织凋亡细胞数量。已知Bcl-2基因家族与凋亡密切相关，Bcl-2对细胞凋亡起抑制作用，Bax作为Bcl-2基因家族中的一员，对细胞凋亡起促进作用，Bax/Bcl-2比值对细胞的存亡起着决定性作用。本实验结果显示，Bcl-2蛋白表达在自然衰老大鼠睾丸组织中显著降低，而Bax蛋白表达显著升高。PNS和TFE联合可显著升高Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白表达。表明联合给药可有效改善衰老大鼠睾丸组织细胞凋亡。

DNA损伤导致的细胞凋亡是衰老公认机制之一，而磷酸化的γ-H2AX与DNA双链断裂关系密切[5-6]。γ-H2AX是DNA损伤标记物，可反映DNA损伤和细胞凋亡与衰老的程度。本实验结果显示，自然衰老大鼠睾丸组织γ-H2AX蛋白表达显著升高，而PNS和TFE联合可显著下调大鼠睾丸组织γ-H2AX蛋白表达。表明联合给药可有效拮抗衰老大鼠睾丸组织DNA损伤，从而抑制生殖细胞的凋亡。

综上所述，PNS和TFE联合给药对自然衰老大鼠睾丸生殖功能衰退有明显的保护作用，其机制可能与抑制DNA损伤相关蛋白γ-H2AX和生殖细胞凋亡有关。但其具体机理尚未明确，仍需进一步研究探讨，为临床研究男性睾丸的衰老提供更加明确的实验依据。

参考文献：

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[2] 刘静，张长城，韩贵芳，等.三七总皂苷对自然衰老大鼠睾丸炎症反应和生殖细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2016，27（5）：644- 649.

[3] 宋来新，赵海霞，袁丁，等.淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠睾丸细胞凋亡及p-P53、p-P38表达的影响[J].中药材，2016，39（10）：2347-2350.

[4] JIANG H， ZHU W J， LI J， et al. Quantitative histological analysis and ultrastructure of the aging human testis[J]. Int Urol Nephrol， 2014，46（5）：879-885.

[5] 余应年.DNA链断裂与DNA损伤和细胞凋亡[J].癌变·畸变·突变， 1999，8（6）：280.

[6] 黄鹏程，周长慧，常艳.基于γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的研究进展[J].中国新药杂志，2016，25（4）：418-424.

（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-03-26；編辑：华强）