微生物脱除真菌毒素机制研究进展

吴丽樱，徐一达，王海鸣，孙秀兰

（1.广州广电计量检测股份有限公司，广东广州510656；2.江南大学协同创新中心，江苏无锡214122）

真菌毒素是由真菌代谢产生的一类有毒天然产物，可在人畜体内蓄积，具有致畸、致癌、肾毒性、肝毒性等危害，对健康造成极大威胁。“真菌毒素”一词首次被使用是在二十世纪六十年代，英国10万多只火鸡由于食用了发霉的花生粉饼而意外死去，当时被称为“火鸡X病”。这种毒素后来被确定为黄曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）。真菌毒素这个词后来被应用到其他真菌的有毒代谢产物，包括伏马毒素、玉米赤霉烯醇、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素等[1]。真菌毒素对粮食、饲料的污染是一个全球性问题，全世界每年约有25%的粮食作物受到污染[2]。因此如何降低真菌毒素污染水平，减少对人畜健康的伤害以及经济损失，是一个历久弥新的话题。

目前脱除真菌毒素的方法主要有物理、化学、生物3种。物理法脱除包括物理吸附、微波、辐射、高压脉冲、挤压膨化等；化学脱除法包括氨气熏蒸，臭氧、二氧化氯等强氧化剂降解。物理化学方法条件剧烈，容易影响甚至破坏产品的营养价值及风味。与之相比，生物脱除法具有反应条件温和、高效、特异性强、环境友好，对原料的风味及营养价值损害较小等优点。部分微生物发酵产物甚至能够增加营养价值或者改善风味。因此，生物法脱除真菌毒素已成为当前研究热点，而微生物降解菌株更是具有广阔的应用前景。本文综述了当前真菌毒素降解菌株筛选方法及几种主要真菌毒素的微生物脱除机制，可为相关研究提供参考。

1 真菌毒素降解菌株的筛选

1.1 真菌毒素降解菌株的自然界筛选

真菌毒素降解菌株往往可以在含有毒素的环境中筛选得到。通常在选择性培养基中添加毒素或者毒素类似物作为唯一碳源来筛选真菌毒素降解菌种。计成等[3]和李俊霞等[4]以香豆素为唯一碳源，分别筛选得到了对黄曲霉毒素B1降解率超过75%和85.7%的菌株。Duvick等[5]从被禾谷镰刀菌污染的玉米、小麦、青贮饲料中筛选出能够降解镰刀菌属产生的毒素，如伏马毒素和玉米赤霉烯酮。此外，还有一些能够降解或者转化真菌毒素的生物菌株可从农业用地的土壤中[6]或者动物肠道中[7]筛选分离得到。在毒素存在的环境中，微生物往往会分泌一些能够降解毒素的蛋白酶来保护自身免受真菌毒素伤害，或者这些微生物在对抗真菌毒素产生菌时具有竞争优势。在消化道中的微生物能帮助动物降解食物中的毒素；在被多环芳烃污染的土壤中也发现了真菌毒素降解菌株，这些微生物产生特定的酶能够降解污染物，也能脱除与污染物结构相似的真菌毒素[8]。

1.2 真菌毒素降解菌株的诱变筛选

从自然界中如污染的土壤、动物肠道、发霉粮食中筛选得到的野生菌株往往存在遗传稳定性差、降解酶产量较低、活力不足等问题，通过诱变法筛选出具有高产降解酶能力的菌株，是解决这一问题的有效途径。

真菌毒素降解菌株的诱变筛选主要可通过物理诱变、化学诱变、生物诱变及复合诱变等方法。常用的物理诱变剂有紫外、X射线、微波辐射、激光等；化学诱变指通过添加叠氮化钠、亚硝基胍、平阳霉素、甲基磺酸乙酯等诱变剂达到诱变目的[9]；生物诱变剂包括DNA片段、转座子、质粒DNA、噬菌体等，可引起DNA的重复、缺失、错配从而发生突变。在真菌毒素降解菌株诱变筛选中，紫外线应用最为广泛、沿用时间最长且诱变效果显著。张晓雪[10]通过紫外线照射成功诱变一株黑曲霉，其对AFB1的脱除率较原菌株提高了34.1%。

1.3 真菌毒素降解菌株的基因改造筛选

随着生物技术科学的迅猛发展，传统的微生物筛选技术已经不能满足需求，通过基因定向改造筛选能够表达特定蛋白的微生物已经成为真菌毒素降解领域的研究热点。利用微生物基因工程，筛选降解酶基因，并进行鉴定、分离和克隆实现降解酶蛋白的高效表达，并将改造后的菌株或者蛋白酶产物应用于粮食、饲料等脱毒。

刘大岭等[11]和Liu等[12]从假密环菌的粗酶液中提取出了一种有效降解AFB1的胞内酶，并将编码该酶的基因序列克隆并在毕赤酵母中成功表达。微生物产物中能发挥毒素降解作用的大都是胞内酶或胞外酶，对粗酶液中获得毒素降解的活性成分，对编码该蛋白的基因测序、克隆，转化到目的载体中表达，从而提高活性物质的产量和质量并进行工业化生产和应用，是未来主要研究方向。这需要应用到分子化学、基因工程等多种技术手段，成本与效率也是亟需解决的问题，因而离实际应用仍有一定的距离。

2 主要真菌毒素微生物降解机制

2.1 黄曲霉毒素（aflatoxins，AF）

黄曲霉毒素是一种由二呋喃环及氧杂萘邻酮构成基本结构的二呋喃香豆素衍生物。AFB1是其中毒性最强的一种，主要作用的靶器官是肝脏，也可引起胆管上皮增生、肝脂质堆积甚至导致肝癌的发生，此外AFB1还会引起机体免疫抑制[13]。

黄曲霉毒素是一种荧光化合物：黄曲霉毒素B族由于其含有内酯环戊酮结构而发出蓝色荧光，而黄曲霉毒素G族含有两内酯而发绿色荧光。黄曲霉毒素的生物降解主要是通过酶促反应使内酯开环，产物丧失荧光性，毒性降低[14]。黄曲霉毒素及其降解产物结构见图1。

很多细菌和真菌如指孢霉（Dactylium dendroides）、根酶属（Rhizopus sp.）、Cornybacterium rubrum等能够通过还原环戊酮上的C-3酮，将AFB1转化成黄曲霉醇（aflatoxicol）（如图1b），且在雏鸭胆管增生试验中发现，黄曲霉醇比 AFB1的毒性小[15]。Samuel等[16]的研究结果显示，恶臭假单胞菌能够将AFB1降解为3种产物，红外结构鉴定表明AFB1上呋喃环及内酯环均被破坏，通过海拉细胞试验证明3种降解产物的毒性均小于AFB1。

图1 黄曲霉毒素及其降解产物Fig.1 Aflatoxin and its degradation products

Liu等[17]从一种食用菌Armilleriella tabescens中提取到胞外酶，该酶可将AFB1转化为一种致突变毒理活性低的产物，降解产物无荧光，表明该酶引起了二呋喃变化而不是破坏分子的内酯部分。从白腐真菌Pleurotus ostreatus和Peniophora sp.中提取到能降解黄曲霉毒素的胞外酶，而这两种白腐真菌对降解木质素和多环芳烃也具有活性[18]。研究表明，白腐真菌具有黄曲霉毒素降解能力是由于能产生一类含铜多酚氧化酶（漆酶）[19]。研究还发现，来自另外一种真菌Trametes versicolor也可产生漆酶降解黄曲霉毒素。

一些放线菌中也被发现黄曲霉毒素降解活性，而它们通常也能够降解污染物。例如，橙色黄杆菌fluoranthenivorans，一株从废弃煤气厂附近分离的土壤细菌，能利用多环芳烃荧蒽为唯一碳源，有效地降解AFB1[8]。红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）也是一种能分解多环芳烃的革兰氏阳性细菌，它的胞外提取物，可以通过对黄曲霉毒素内酯环的破坏使其丧失荧光性，降解成低毒产物[19]。Lapalikar等[20]阐释了另一种名为耻垢分歧杆菌（Mycobacterium smegmatis）的放线菌降解黄曲霉毒素B1和G1的机制，该菌产生的还原酶还原C-2和C-6之间的α，β-不饱和双键（如图1c），随后毒素自发裂解。

AFB1是一种呋喃香豆素，可以降解其他香豆素和呋喃香豆素的一些细菌也可以降解AFB1。Guan等[7]从农场土壤和动物园动物的粪便中分离出一些细菌，包括芽孢杆菌、肠杆菌、红球菌和短杆菌，这些能够利用简单的植物成分香豆素为唯一碳源的细菌，其大多数菌株也能降解黄曲霉毒素。例如，嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），一种从貘粪便中分离得到细菌，可以在72 h内降解80%的黄曲霉毒素，同时该菌也能降解多环芳烃[21]。由于并没有发现黄曲霉毒素代谢产物，因此这种降解的机制尚不清楚。

2.2 赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）

OTA是一种异香豆素（结构如图2a所示），由赭曲霉毒素α（结构如图2c所示）通过酰胺键与L-β-苯基丙氨酸（结构如图2b所示）相连络合而成。

图2 赭曲霉素及其降解产物Fig.2 Ochratoxin and its degradation products

研究已经证实了OTA具有肾毒性、肝毒性、致畸性和致癌性，并妨碍铁的吸收，而它的降解产物赭曲霉毒素α和苯丙氨酸对机体无负面影响[22]。OTA的产生菌在湿热的南方一般以赭曲霉菌为主，水分大于16%的粮食和饲料会受到其侵害；而寒冷于燥的北方以青霉菌为主，在0℃左右仍有青霉菌生长，给饲料贮藏带来极大困难。

土壤中的一些短杆菌，如亚麻短杆菌（Brevibacterium.linens）、表皮短杆菌 （Brevibacterium.epidermidis）、凯氏短杆菌（Brevibacterium.casei）等具有改变芳香族化合物结构的能力，其往往也能够降解OTA[23]。短杆菌降解OTA的主要机制是由于其能够产生一种羧肽酶A将酰胺键水解，这种水解作用可能是一种羧化作用[24]。

酿酒酵母，红酵母，隐球菌，Trichosporon mycotoxinivorans可以水解OTA的酰胺键产生无毒的苯丙氨酸和赭曲霉毒素α。Trichosporon mycotoxinivorans酵母在降解玉米赤霉烯酮时是通过裂解内酯环的模式脱毒的，而在作用OTA时，它的内酯结构并没有遭到破坏[25]。Phenylobacterium immobile可利用苯丙氨酸为唯一碳源，通过破坏苯丙氨酸的苯基部分，将毒素转化为无毒的赭曲霉毒素α和其他三种代谢产物[26]。

2.3 伏马毒素（fumonisins，FB）

在自然界中产生伏马菌素的真菌主要是串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）和多育镰刀菌（Fusarium proliferatum）。这两种真菌广泛存在于各种粮食及其制品中，因此它们产生的伏马菌素容易污染粮食类农产品，尤其是玉米。即使在干燥温暖的环境中，串珠镰刀菌是玉米中出现最频繁的菌种之一。

伏马毒素是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，包含一条由20个碳组成的脂肪链和14、15号碳链上连接的两个相同酯键侧链[27]。目前约有28种伏马毒素类似物，根据结构可分为4类，其中以伏马毒素B1（FB1）分布最广，毒性最强。目前认为伏马毒素的毒性作用主要与其抑制鞘脂类物质的合成有关。神经鞘脂类作为真核细胞细胞膜的重要组成成分，对细胞的附着、分化、生长和程序化死亡起关键性作用[28]。

Benedetti等[29]和Duvick等[30]已从土壤和玉米芯中分别得到能够降解伏马毒素的细菌和真菌。杨朋飞等[31]以FB1为唯一碳源，从污泥样品中分离到1株高效降解FB1的菌株，该菌在液体无机盐培养基中对FB1的脱除有良好的效果，可在5 d内可将25 μg的FB1全部降解。这些微生物能够将伏马毒素作为唯一碳源，并推测其降解机制主要包含两步（如图3所示）：第一步羧酸酯酶去除C-15和C-15三羧酸基团，将FB1转化为水解伏马毒素B1（HFB1）；第二步在转氨酶的作用下将HFB1转化成2-酮-HFB1。在这个过程中，羧酸酯酶基因（fumd）和氨基转移酶基因（fumI）和一些包含转录调控基因、转运基因和其他涉及伏马毒素降解的基因簇参与了毒素降解过程[32]。

2.4 展青霉素（patulin）

展青霉素是一种不饱和杂环内酯，主要由青霉菌产生，是水果采摘后的一种重要真菌毒素污染物，通常出现在水果和果汁中，造成重大的经济损失并引发一系列安全问题[33]。急性暴露展青霉素可引起恶心和胃炎，慢性暴露展青霉素有神经毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性[34]。它能与含巯基化合物如半胱氨酸或谷胱甘肽形成共价加合物，使含巯基的活性位点失效[34]。展青霉素及其降解产物结构见图4。

尽管展青霉素是一种广谱抗生素，很多细菌和酵母依然可以降解展青霉素。Moss等[35]研究发现酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在无氧发酵过程中能够降解展青霉素，而在有氧的环境中，酵母增殖对展青霉素并没有降解作用。酿酒酵母可以通过打开展青霉素的吡喃环将其转化为（E）-ascladiol。因此，将果汁发酵成酒或者醋是一种有效去除展青霉素的方式。Ri－celli等[36]从腐烂的含有较高含量展青霉素的苹果泥中分离得到一株革兰氏阳性菌Gluconobacter oxydans，能将展青霉素转化成（E）-ascladiol，而（E）-ascladiol是展青霉素合成的一种前体，其毒性大约只有展青霉素的25%。

一些酵母如 Pichia ohmeri，isolated from ant hills，Pichia membranifaciens和Sporobolomyces roseus等不仅可以抑制展青霉素产生菌的生长，也同样可以降解展青霉素[37]。研究表明，酵母Rhodosporidum kratochvilovae降解展青霉素的机制是将其转化为脱氧酪氨酸（desoxypatulinic acid），该物质没有半缩醛和内酯结构，无法与巯基反应，淋巴细胞试验显示，脱氧酪氨酸毒性较展青霉素小得多[34]。

图3 伏马毒素及其降解产物Fig.3 Fumonisins and its degradation products

图4 展青霉素及其降解产物Fig.4 Patulin and its degradation products

2.5 玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）

玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）等产生的一类二羟基苯甲酸内酯类真菌毒素，其急性毒性较相对较低，其慢性毒性主要表现为生殖毒性，以及对内分泌系统的影响[38]。由于ZEN与雌性激素雌二醇结构相似，通过被动运输的方法进入到细胞内，与雌激素受体发生结合，从而导致生物体内的激素不能正常工作。ZEN生物活性的重要特征结构是内酯环和C-4羟基。通常以测定与雌激素受体结合实验来评估其雌激素活性的，雌激素活性丧失代表脱毒成功（ZEN及其降解产物结构见图5）。

图5 玉米赤霉烯酮及其降解产物Fig.5 Zearalenone and its degradation products

真菌脱除ZEN的机制主要包括羟基酮的还原、双键断裂、羟基化、甲基化、硫化作用、糖基化、环破裂等。根霉、链格孢菌等多种微生物能将ZEN中C-6酮转化成 α-玉米赤霉醇（α-zearalenol）和β-玉米赤霉醇（βzearalenol）产物[39]。虽然 β-玉米赤霉醇（β-zearalenol）的雌激素毒性比ZEN小很多，但是α-玉米赤霉醇被证明其毒性是ZEN的10倍～20倍。

破坏ZEN的C-4羟基可导致雌激素活性损失。例如，Cunninghamella bainieri能将ZEN转化成2，4-二甲氧基，Rhizopus arrhizus可以将ZEN转化为玉米赤霉烯酮-4-硫酸盐，这两种产物都不具有雌激素活性。Kakeya等[40]对粉红粘帚霉菌株降解ZEN机制进行了研究，发现主要起作用的是该菌分泌的一种蛋白酶，该酶可将ZEN，α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇降解成无毒产物，并克隆出了编码该蛋白的基因zhd101，导入该基因片段的大肠埃希氏菌同样具有将ZEN降解成无毒产物能力。

3 微生物脱除真菌毒素的应用

3.1 在食品中的应用

发酵是一种古老的食品加工和保藏方式，其起源可以追溯到7 000多年前的古代巴比伦。酵母和乳酸菌常被用于发酵粮食、果汁、啤酒等，被认为是一种天然有机的食品深加工方式。在过去的研究中已经证实了可通过乳酸菌发酵玉米来脱除真菌毒素[41]。乳酸菌发酵不仅反应条件温和，而且可以保持食品的营养，改善风味，在降解真菌毒素的同时不产生有毒代谢产物，这种毒素脱除方式被证明主要是乳酸菌细胞壁的肽聚糖通过疏水结合或共价结合等方式吸附并清除毒素[42]。Oluwafemi等[43]研究了乳酸菌降低受污染的玉米籽粒上AFB1的能力。在玉米籽粒中接种了能产黄曲霉毒素的菌株A.flavus，结果证明，不同种类的乳酸菌对脱除AFB1的能力相差较大。尽管有些食品中的乳酸菌相对丰度较高，但是具有毒素结合能力的却只有极少部分。因此，可以根据毒素脱除能力筛选出特定功能的乳酸菌作为发酵剂应用于发酵工业。

在酿酒工业中，酿酒酵母也表现出了不同的毒素脱除能力。Caridi等[44]报导了酿酒酵母Saccharomyces sensu stricto在葡萄酒酿造过程中脱除OTA的能力，他从20株酿酒酵母中筛选出了7株具有较强OTA脱除能力的菌株，在25℃条件下发酵90 d，可以将OTA从66%～100%不同程度地进行脱除，且证明了从葡萄酒中脱除OTA是酿酒酵母的细胞壁发挥了作用。随后，Caridi又探究了具有OTA吸附能力的菌株亲本及其后代，结果表明OTA吸附能力是由多基因共同控制[45]。有学者通过透射电子显微镜对酵母的细胞壁进行了超微结构分析，发现酿酒酵母的细胞直径或细胞壁厚度影响其对真菌毒素的清除能力[46]。

3.2 在动物饲料中的应用

真菌毒素在全球饲料和饲料原料中污染严重，对养殖业甚至人类健康都带来巨大威胁。某些微生物具有脱除毒素的功能，将其作为饲料添加剂应用于饲料工业的研究在上世纪20年代就已经开展。He等[47]曾报导了微生物在仔猪无氧环境的胃肠道中可以脱除约50%的霉变玉米饲料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）毒素；1998 年，具有净化毒素功能的菌株Eubacterium BBSH 797被百奥明公司作为饲料添加剂开始商品化，名为Mycofix plus（BiominR），并在多个国家使用。动物实验结果显示，Mycofix产品可以显著降低DON对奶牛以及T-2毒素对肉鸡生长的不利影响，且可以增强奶牛瘤胃的菌群活性[48]。Karlovsky[49]报道了其他一些微生物，如Curtobacterium sp.114-2，Pseudotaphrina kochii，Agrobacterium-Rhizobium E3-39，Nocardioides sp.WSN05-2可以脱除 DON毒素，同样能够应用于饲料添加剂，且具有脱毒活性的基因通过基因工程可将其植入作物。

4 展望

利用微生物消减真菌毒素的研究已持续几十年，其降解机制主要是微生物将真菌毒素作为一种营养物质，对其进行了转化和吸收，从而达到脱毒的目的。在降解过程中，微生物代谢产生的相关的代谢酶系参与了反应。目前已有相关的商品化产品作为饲料添加剂使用。并且，控制产生脱毒作用的酶的基因，如单端孢霉烯乙酰转氨酶酶基因（TR I101）[50]、玉米赤霉烯酮内酯水解酶基因（zhd101）[51]已经在植物中被表达，能够在作物收获前限制毒素的产生。同时，一些毒素也是一些作物疾病的毒力因子，如镰刀菌枯萎病，引入抗性基因可以抵御这些疾病。因此，如何识别、纯化出相关降解酶，并使微生物高产目的酶将其应用于实际生产中，是目前研究的主要方向，且具有很好的市场前景。当前相关的研究主要集中于筛选、克隆对真菌毒素有专一降解作用的生物活性酶基因，以及采用生物技术培育抗真菌毒素的优良农作物品种。随着产毒真菌基因组测序的完成和基因组学、蛋白组学和代谢组学等新技术的出现，利用生物技术消减、防控真菌毒素的研究将迎来前所未有的发展机遇。