熊果酸标准样品的研制

王岱杰，于金倩，崔莉，付瑞明，宋祥云，耿岩玲

（山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南250014）

熊果酸（ursolic acid），又名乌索酸，是广泛存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物（结构见图1），现代药理研究表明，熊果酸具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒、保肝、抗抑郁、降低大脑氧化损伤、治疗糖尿病和杀虫等多种特性[1-15]，同时对肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多种癌症细胞模型具有良好的抑制效果[16-23]。熊果酸是《药典》规定的山楂、木瓜、乌梅、山茱萸和大叶紫珠等12味药材及相关复方的鉴别和质量控制指标[24]，同时山楂、木瓜、乌梅和山茱萸都是药食同源或可用于保健食品的植物，目前市场上熊果酸样品主要以对照品为主，纯度参差不齐，未按照国家标准进行均匀性、稳定性和定值试验，最终结果没有不确定度评价，样品也不具有溯源性，制约了各类以山楂、木瓜、乌梅和山茱萸等为原料的中药、食品、保健品等产品的质量控制，因而亟需标准化的熊果酸标准样品。

标准样品是具有一种或多种足够均匀的和很好确定了特性值的材料或物质，可以用来校准仪器、评价测量方法和给材料赋值[25]。随着天然产物包括中药材市场国际化的发展，研制与国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）对接的标准样品的需求愈发迫切，也是国内外研究的热点。目前，我国研发的天然产物标准样品种类和数量严重不足，影响相关产品的检测，也制约了相关行业的发展。为改善这一现状，我国天然产物标准样品的研究正在广泛开展[26]。因此，为了满足熊果酸及相关产品的检测需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，本文参照ISO导则35和GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》[27]，以蔷薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果实为原料，成功研制了熊果酸国家标准样品。

图1 熊果酸化学结构式Fig.1 The chemical structure of ursolic acid

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

NKA型大孔树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司；柱层析硅胶、GF254薄层硅胶板：青岛海洋化工厂；高效液相色谱用甲醇（色谱纯）：美国天地公司；水为重蒸水；其它试剂为分析纯；山楂药材：济南建联中药店，经山东中医药大学李佳教授鉴定为蔷薇科植物山楂的干燥成熟果实，样本存放于山东省分析测试中心。

1.2 仪器与设备

R-3型旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；SCIENTZ-10N型冷冻干燥仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；E2695型高效液相色谱仪：美国waters公司；ZF-I型三用紫外分析仪：上海顾村电光仪器厂；TH-II型薄层加热器：上海科哲生化科技有限公司；WRS-1B型数字熔点仪：上海精密科学仪器有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；INOVA 600 MHz核磁共振波谱仪：美国瓦里安公司；6520 Q-ToF型液质联用仪：美国安捷伦公司；STA 449FC型同步热分析仪：德国耐驰公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

取山楂药材5 kg粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，等体积石油醚脱脂3次，水溶液进行NKA大孔树脂富集，分别用纯水、25%乙醇、50%乙醇、85%乙醇、95%乙醇洗脱，85%乙醇洗脱部分浓缩，冷冻干燥，得熊果酸粗品。将熊果酸粗品经硅胶柱色谱反复分离，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，收集含熊果酸组分。薄层色谱跟踪监测，石油醚∶乙酸乙酯（4∶1，体积比）为展开剂。将收集到的相同部分放置在通风橱内，乙醇重结晶，过滤并干燥。

1.3.2 纯度分析方法

1.3.2.1 高效液相色谱分析

等度条件：shim-pack C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液（91∶9，体积比）；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；运行时间：35 min；检测波长：210nm；样品浓度0.2mg/mL，甲醇溶解。梯度条件：YMC C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A 为甲醇，B 为 0.2%乙酸水溶液；0～25 min，91%A，25 min～45 min，91%A～100%A，45 min～55 min，100%A。流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；运行时间：55 min；检测波长：210 nm，样品同上。

1.3.2.2 薄层鉴别

精密称取样品5mg，加甲醇配制成浓度为0.2 mg/mL对照品溶液。展开剂分别为氯仿-甲醇（100∶1，体积比）和石油醚-乙酸乙酯（4∶1，体积比），定量毛细点样管吸取 20、40、60、80、100 μg，梯度将样品点于 GF254硅胶板。两种展开剂分别展开，取出，晾干，分别用10%硫酸乙醇法显色，105℃下加热3 min，至斑点显色清晰。

1.3.2.3 高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）纯度分析

分析条件：shim-pack C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇/0.2%乙酸水溶液（91∶9，体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；运行时间：30 min。MS条件：ESI电喷雾离子源，毛细管电压为4.0 kV，载气为载气，载气流速为10 L/min，载气温度为300℃，扫描范围 m/z 100～1 000。

1.3.2.4 热重分析

精密称取样品5 mg，置于热重用坩埚中，热重条件：初温30℃，最终温度600℃，升温速率10℃/min，气体 N2，流量 100 mL/min。

1.3.3 结构表征

熊果酸单体的结构表征采用紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振等技术。紫外光谱法的测试溶剂为甲醇，扫描范围为200 nm～400 nm；红外光谱法采用KBr压片，扫描波数为 400 cm-1～4 000 cm-1；质谱为电喷雾离子源，载气温度为300℃，载气流速为10 L/min，载气为载气，毛细管电压为4.0 kV，扫描范围m/z为100～1 000；核磁共振法的氘代试剂为DMSO-d6。

1.3.4 均匀性检验

依据标准样品导则（均匀性研究）要求[27]，采用顺序重复随机测量，随机抽取分装好的熊果酸样品10瓶，3种抽样程序（第1种1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第 2种 10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第 3 种 2-4-6-8-10-1-3-5-7-9），样品按1.3.2中规定纯度方法进行分析，样品纯度读取采用峰面积归一化法，采用方差分析法进行数据分析。

1.3.5 稳定性检验

熊果酸样品储存温度为0℃～4℃，考察样品的2年稳定期，分5个时间段考察监测，按1.3.2中规定纯度方法进行分析，样品纯度读取采用峰面积归一化法，每份样品测定5次，统计分析采用t检验法[28]。

1.3.6 定值

根据工作导则，标准样品的定值采用8家实验室协作进行的方法。随机抽取样品24瓶，每家定值实验室寄出样品3瓶，每瓶测定2次，协作实验室共出6个检测结果，样品纯度以峰面积归一化法读取[27-28]。

2 结果与分析

2.1 纯度分析

采用HPLC的二极管阵列检测器对色谱峰进行3D总吸收图扫描，检测结果扣除溶剂峰，HPLC纯度分析结果见图2、图3和图4。

图2 熊果酸等度洗脱HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of ursolic acid by socratic elution

图3 熊果酸梯度洗脱HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram by gradient elution

图4 熊果酸HPLC 3D扫描图Fig.4 Three dimensional chromatogram of ursolic acid by HPLC

由图2～图4可知，未见明显杂质峰存在，样品纯度良好。以氯仿-甲醇（100∶1，体积比）和石油醚-乙酸乙酯（4∶1，体积比）为展开剂进行薄层色谱检测，10%硫酸乙醇显色。薄层结果表明，样品呈现紫红色斑点，Rf值分别为0.51和0.49，未见明显杂质斑点存在。

HPLC-MS的检测结果见图5。

图5 熊果酸样品的液质谱总离子流图Fig.5 Total ionic chromatogram of ursolic acid by HPLC-MS

由图5可知，未见明显的杂质峰存在。

热重分析的结果见图6。

图6 熊果酸的热重图Fig.6 The thermogravimetric curve of ursolic acid

由图6可知，在25℃～189℃温度范围内，热重分析曲线是一条水平线，表明测试样品中吸附水和结晶水含量很低，热稳定性好。当温度增加超过189℃时，样品开始分解，差热分析法（differential thermal analysis，DTA）曲线显示温度升高到261.5℃，样品迅速分解。

2.2 结构表征

2.3 均匀性检验

将结果进行F检验，进行数据统计，确定熊果酸样品的均匀性，结果见表1和表2。

表1 均匀性检验数据Table 1 Results of homogeneity test %

表2 方差分析数据Table 2 Results of variance analysis

瓶间方差的计算公式：

则瓶间标准偏差为：

F值的计算公式：

以组间自由度υ1=9及组内自由度υ2=20为变量查询F界值表，可知临界值F0.05（9，20）=2.94，由于F＜F0.05（9，20），因此所研制的熊果酸标准样品具有良好的均匀性。

2.4 稳定性检验

采用t检验法对稳定性检测结果统计分析，采用直线模型，观察直线斜率值变化趋势，同时进行预测，结果见表3。

表3 稳定性检验数据Table 3 Result of stability test %

斜率计算公式如下：

式中：y=99.79；x=12。

截距计算公式如下：

直线模型的标准偏差：

则s=0.03

斜率相关不确定度计算公式如下：

查表得自由度为n-2和95%置信水平（p=0.95）分布的t因子为3.182。

由于斜率变化的绝对值|b1|＜t0.95，n-2·s（b1）=3.182×0.002=0.009 5，

即：|b1|＜0.009 5。

因此，斜率变化不显著，即熊果酸标准样品在两年内稳定性良好。

稳定性的不确定度为：

u稳=Sb×t=0.003×24=0.08

2.5 定值

根据各个协作实验室的反馈结果，进行数据的统计分析，并最终确定熊果酸标准样品的标准值和不确定度，统计结果如表4。

表4 协作定值数据Table 4 Results of purity value results %

测定结果总平均值的计算公式如下：

实验室平均值的标准偏差为：

总平均值标准偏差为：

多家定值引入的不确定度

熊果酸标准样品的不确定度由如下3部分组分：（1）均匀性检验不确定度；（2）稳定性检验不确定度；（3）定值不确定度，这3部分不确定度分量互不相关，需将3种不确定度合成，即合成不确定度（U合成）为：

代入数据计算得U合成=0.09%

置信区间95%时，k=2

则熊果酸标准样品的扩展不确定度：

3 结论

本研究针对熊果酸及相关产品缺乏国家标准样品的现状，严格按照国标规定的标样样品研制规则，成功的研制出熊果酸标准样品，并顺利通过了专家验收。研制过程中对标准样品的均匀性进行考察，并进行方差分析；稳定性检验采用直线模型，并进行了t检验法考察；定值采用多家实验室协作，对定值结果进行统计分析。根据3个方面引入的不确定度，进行了不确定度的合成和扩展，获得了标准值为99.80%，置信度95%的不确定度为0.18%的熊果酸国家标准样品，具有样品溯源性，可用于相关产品的检测方法评定和含量测定，填补了熊果酸标准样品的国内外空白。