板栗壳多酚的提取及其抗氧化性能的研究

王敏，田珍燕，王蔚新

（黄冈师范学院生命科学学院，大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北省经济林木种质改良重点实验室，湖北黄州 438000）

板栗属壳斗科栗属坚果类植物，为落叶乔木。板栗果肉的开发利用一直受到广泛关注，作为加工废弃物——板栗壳，还没有得到有效地开发和利用。从板栗壳中提取出来的色素，是一种水溶性好、着色力强、性质稳定的天然棕色素[1]。其主要活性成分为多酚类化合物，有一定的抗氧化和抑菌等作用，广泛用于食品、日用化学用品和药品等产品的生产。

植物多酚类化合物的传统提取溶剂多为乙醇、酸、碱等，但这些溶剂成本高、污染性强，且有残留风险。采用水作为提取溶剂，具有廉价、环保、更适合工业生产的优点。超声波能促进植物细胞内的可溶性物质快速溶解到溶剂中，可用于各种植物活性成分的辅助提取，具有耗时短、得率高、消耗溶剂少等特点。蒋孟君等[2]采用超声波辅助提取可食用玫瑰花多酚，总多酚含量达到93.81 mg/g，效果显著。植物多酚抗肿瘤、抗衰老等生理活性与其具有的清除自由基和抗氧化能力密切相关[3]。马承慧等[4]究了松针多酚对DPPH·和·OH两种自由基的清除效果，结果表明其具有较好的抗氧化能力。目前板栗总苞、种皮中含有的多酚物质已有一定研究，如石恩慧等[5]研究了板栗总苞多酚的抗氧化性，匙丹丹[6]研究了板栗种皮提取、纯化和相关性质。但板栗壳（中果皮）中多酚相关研究相对较少，不足以为板栗壳的相关研究提供更加完整的理论依据。本研究采用超声波辅助水提法提取板栗壳多酚物质，并通过测定板栗壳多酚提取液总抗氧化能力及其对5种不同抗氧化体系的清除效果，研究其抗氧化活性，旨在为板栗壳多酚的开发利用提供科学依据，同时实现变废为宝，进一步促进板栗产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗：黄冈市黄商集团购物中心。

福林酚试剂（生化试剂）：合肥博美生物；没食子酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；大孔树脂（AB-8型）：陕西乐博生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；盐酸（分析纯）：中平能化集团开封东大化工有限公司；铁氰化钾（分析纯）：CANSPEC CHINA；维生素C（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司等。

1.2 仪器与设备

UV-2600紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SB25-12DTDN型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；普通玻璃层析柱（2.0 cm×45 cm）：陕西乐博生化科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 多酚标准曲线的建立

称取0.250 g没食子酸，用水溶解定容至50 mL，分别取母液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于50 mL容量瓶中稀释成不同浓度梯度的备用液。分别从上述备用液中取0.2 mL置于10 mL容量瓶中，再分别加入0.5 mL福林酚混匀，30 s之后加入1.5 mL 20%碳酸钠溶液，混匀、定容、暗处放置2 h后760 nm处测吸光度。

1.3.2 总多酚的测定及提取率计算

取10 g板栗壳粉按料液比1∶30（g/mL）添加甲醇于500 mL圆底烧瓶中，70℃水浴回流1 h。过滤取滤液同上利用福林酚试剂法测吸光度（以没食子酸计）。根据回归方程计算提取率：

多酚提取率（按没食子酸计）（mg/g）=（[C×V/M）/1 000]×100%

式中：C为多酚质量浓度，μg/mL；V为多酚提取液总体积，mL；M为板栗壳粉质量，g。

1.3.3 板栗壳多酚粗提液的制备工艺流程

板栗壳→去杂、清洗、烘干→粉碎→加水超声波提取→过滤取滤液→测吸光度→计算提取率（以没食子酸计）

1.3.4 多酚提取工艺优化

分别研究料液比、超声时间、超声功率、超声温度这4个因素对板栗壳多酚提取率的影响。料液比取1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）；超声时间取 0.5、1.0、1.5、2.0 h；超声功率取 200、300、400、500 W；超声温度取 35、50、65、80 ℃。

1.4 大孔吸附树脂分离纯化板栗壳多酚的工艺流程

新树脂先用95%乙醇浸泡24 h至充分溶胀后，装柱，用去离子水洗至无醇味残留[7]。将100 mL板栗壳多酚粗提液以2 BV/h过柱，以10 mL每管收集，以去离子水作为参比液，依次在380 nm条件下测定吸光度，达到泄漏点（多酚浓度为初始的1/10）时停止加样，水洗未吸附残液至流出液为无色，用紫环反应检测洗脱终点，最后用100 mL 50%乙醇溶液以2 BV/h过柱洗脱至无色。

1.5 板栗壳多酚的抗氧化性测定

1.5.1 总抗氧化能力的测定

分别取 1.00 mL 不同质量浓度（30、60、90、120、150 μg/mL）的样品溶液与系列同等质量浓度的VC溶液置于试管中，再加入0.2 mol/L、pH值＝6.6磷酸钠缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，在50℃水浴中放置20min后，加入2.5mL质量分数为10%的三氯乙酸，取混合液5mL并加入4 mL去离子水和1.0 mL、0.1%氯化铁溶液，混合均匀，在700 nm下测定其吸光度A（以VC作为对照品）。吸光度越高，则总抗氧化能力越强[8]。

1.5.2 DPPH·清除率测定

参考朱洁等[10]的方法，并作适当修改。分别取2.0 mL 不同质量浓度（5、10、15、20、25、30、60、90、120、150 μg/mL）的样品溶液与系列同等质量浓度的VC溶液，再分别加入等量0.057 mg/mL用无水乙醇配制的DPPH溶液，摇匀反应30 min，在517 nm下测定吸光度为A1。用体积分数为50%的乙醇溶液代替样品液测定吸光度A0，用无水乙醇代替DPPH溶液测定吸光度A2。DPPH·清除率的计算见公式：

1.5.3 O2-·清除率测定

参考李霄等[9]的方法，并作适当修改。各个试管分别吸取50 mmol/L、pH=8.2的Tris-HCI缓冲液4.5 mL，在25℃水浴中放置20 min后，再分别加入1.0 mL不同质量浓度（10、20、30、60、90、120、150 μg/mL）的样品溶液与系列同等质量浓度的VC溶液，然后加入0.4 mL、25.0 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后在25℃水浴中放置5 min，最后加入终止反应液1.0 mL、8.0 mol/L的HCl溶液，在波长为325 nm处测定吸光度A1。用双蒸水代替样品液测定吸光度A0。按下式计算清除率：

1.5.4 ABTS+·清除率测定

参考范金波等[11]的方法，并作适当修改。取适量体积7 mmol/L的ABTS溶液和等体积2.4 mmol/L的过硫酸钾溶液，混合均匀后室温避光放置12 h～16 h，形成ABTS+·母液备用。然后在734 nm波长处，将ABTS+·母液用10 mm/L、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释至吸光度为0.70±0.002，记作A0。分别取60 μL不同质量浓度（30、60、90、120、150 μg/mL）的样品溶液与系列同等质量浓度的VC溶液，再分别加入6.0 mL ABTS+·母液，摇匀后室温避光放置10 min，在波长为734 nm处测定吸光度为A1。用蒸馏水代替ABTS+·母液测定吸光度为A2。 ABTS+·清除率的计算同公式（1）。

1.5.5 NaNO2清除率测定

参考朱洁等[10]的方法，并作适当修改。分别取2.0mL不同质量浓度（30、60、90、120、150 μg/mL）的样品溶液与系列同等质量浓度的VC溶液，再分别加入1.0 mL、5 μg/mL亚硝酸钠溶液，摇匀后于37℃水浴30 min，取出立即加入1.0 mL、0.4%对氨基苯磺酸溶液，充分混匀后室温放置15 min，再依次加入500 μL、0.2%盐酸萘乙二胺溶液，混合均匀后静置显色15 min，在536 nm波长处测定吸光度A1。用50%乙醇代替样品测定吸光度为A0，用蒸馏水代替盐酸萘乙二胺溶液测定吸光度A2。亚硝酸基清除率的计算同公式（1）。

1.5.6·OH清除率测定

参考马承慧等[4]的方法，并作适当修改。分别取1.0 mL 不同质量浓度（30、60、90、120、150 μg/mL）的样品溶液与同等质量浓度的VC溶液，再分别加入1 mL、1 mmol/L硫酸亚铁溶液和等体积1 mmol/L的过氧化氢溶液，以及2 mL、3 mmol/L邻羟基苯甲酸溶液，摇匀后于37℃水浴30 min，在510 nm处测定吸光度A1。用蒸馏水代替邻羟基苯甲酸测定吸光度A2，用蒸馏水代替样品溶液测定吸光度A0。羟自由基清除率的计算同公式（1）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以没食子酸标准品的浓度为横坐标，以760 nm波长处的吸光度A为纵坐标（Y），绘制标准曲线，如图1。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

回归方程为：y=0.002 2x+0.022 5，R2=0.996 7。依据标准曲线，得到没食子酸在质量浓度为50 μg/mL～500 μg/mL区间内具有良好的线性关系。

2.2 总多酚测定及提取率计算

由吸光度的平均值计算可知：板栗壳粉总多酚含量为16.6 mg/g板栗壳粉，用于计算板栗壳多酚的提取率。

2.3 超声波提取单因素试验

2.3.1 料液比对多酚提取率的影响

以料液比为横坐标，以板栗壳多酚提取率为纵坐标，考察料液比对多酚提取率的影响，如图2。

由图2可知，随着料液比的增大，板栗壳多酚提取率逐渐增大，但从1∶40（g/mL）处增长开始变缓慢，由此设定1∶40（g/mL）为较优料液比。出现该现象的原因可能是当板栗壳的量一定时，增加水的量可以降低板栗壳多酚浓度，从而更有利于多酚的溶出[12]。因此，在实际生产中可以采用适当加大料液比的方法来获得最大的提取率，但过大的料液比会增加水的用量，多酚含量几乎不变，同时在工业上出现用水量大、经济支出高、不易浓缩的问题。

2.3.2 超声波时间对多酚提取率的影响

以超声时间为横坐标，以板栗壳多酚提取率为纵坐标，考察超声时间对多酚提取率的影响，如图3。

图2 料液比对多酚提取率的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of polyphenols

图3 超声时间对多酚提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasound time on the extraction rate of polyphenols

由图3可知，随着超声时间的增加，板栗壳多酚的提取率逐渐增大，从1.5 h处增长开始变缓慢。原因可能是过长的超声时间会导致部分板栗壳多酚发生氧化，因损耗而影响提取率。由此设定1.5 h为较优超声时间。

2.3.3 超声波功率对多酚提取率的影响

以超声功率为横坐标，以板栗壳多酚提取率为纵坐标，考察超声功率对多酚提取率的影响，如图4。

由图4可知，随着超声功率的增大，板栗壳多酚提取率先增大后减小，在功率400 W处出现峰值，说明较优的超声功率为400 W。

2.3.4 超声波温度对多酚提取率的影响

以超声温度为横坐标，以板栗壳多酚提取率为纵坐标，考察超声温度对多酚提取率的影响，如图5。

图4 超声功率对多酚提取率的影响Fig.4 Effects of ultrasound power on the extraction rate of polyphenols

图5 超声温度对多酚提取率的影响Fig.5 Effects of ultrasound temperature on the extraction rate of polyphenols

由图5可知，板栗壳多酚提取率整体随着超声温度升高而增大，提取率先逐渐增大，但在65℃处开始呈现减小趋势。原因可能是随着温度的升高，部分板栗壳多酚氧化损耗。因温度65℃处出现峰值，故设定65℃为较优的超声温度。

2.4 超声波提取正交试验

根据单因素试验结果，设定正交因素水平表1，按照L9（34）正交表进行正交试验见表2。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of this experiment

由正交试验表得出最优提取工艺条件为A3B1C1D2，即液料比 1 ∶45（g/mL）、超声时间 1 h、超声功率350 W、超声温度65℃。经验证，在最优提取工艺条件下板栗壳多酚的提取率达到96.9%，该结果比正交表中试验号8的提取率略低，原因可能是各单因素之间存在交互作用。但试验号8耗时更长、超声温度更高，从生产成本方面考虑不具优势。

3 板栗壳抗氧化试验

3.1 板栗壳多酚的总抗氧化性

按照1.5.1试验方法进行试验，以板栗壳多酚浓度为横坐标，以吸光度A为纵坐标，板栗壳多酚的总抗氧化能力如图6。

图6 板栗壳多酚的总抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of polyphenols from Chestnut Shell

由图6可知，在一定浓度范围内，板栗壳多酚提取液的总抗氧化能力随着质量浓度的增加而增强，且板栗壳多酚的总抗氧化能力整体优于VC。本试验结果与其买古丽·阿沙木等[8]研究的野蔷薇多酚总抗氧化实验趋势基本相同，区别在于野蔷薇多酚的总抗氧化能力弱于VC。

3.2 板栗壳多酚对DPPH·的清除作用

按照1.5.2试验方法进行试验，以板栗壳多酚浓度为横坐标，以DPPH·的清除率为纵坐标，板栗壳多酚清除DPPH·的效果如图7。

图7 板栗壳多酚清除DPPH·的效果Fig.7 Effects of scavenging DPPH·on polyphenols from Chestnut Shell

植物多酚可与DPPH·中的单电子配对，从而发生氧化使紫色醇溶液出现褪色现象。由图7可看出，板栗壳多酚和VC都具有清除DPPH·的能力。当板栗壳多酚浓度低于25 μg/mL时，其清除DPPH·能力优于VC；当板栗壳多酚浓度高于25 μg/mL时，其清除能力弱于VC，且其清除能力随着质量浓度的增加而减弱，究其原因，相关文献并未给出解释，具体原因还有待进一步探究。从李霄等[9]研究马铃薯皮多酚清除DPPH·试验中发现了类似结果，即低浓度马铃薯皮多酚清除DPPH·能力优于VC，高浓度马铃薯皮多酚清除DPPH·能力弱于VC。由此可说明，在低浓度条件下板栗壳多酚清除DPPH·的能力比VC强。

3.3 板栗壳多酚对超氧阴离子的清除作用

按照1.5.3试验方法进行试验，以板栗壳多酚浓度为横坐标，以O2-·的清除率为纵坐标，板栗壳多酚清除O2-·的效果如图 8。

图8 板栗壳多酚清除O2-·的效果Fig.8 Effects of scavenging O2-·on polyphenols from Chestnut Shell

由图8可看出，板栗壳多酚清除O2-·能力整体弱于VC。随着质量浓度的增加，VC的清除能力逐渐增大，而板栗壳多酚在质量浓度为20 μg/mL时出现清除率峰值。当浓度高于20 μg/mL时，板栗壳多酚的清除能力随着质量浓度的增加逐渐减弱，且在120 μg/mL时趋于平缓。从李霄等[9]及刘宁等[13]研究试验中发现类似现象，但均未给出合理解释，出现该现象的具体原因还有待进一步探究。因此，在低浓度条件下板栗壳多酚具有清除O2-·的能力。

3.4 板栗壳多酚对ABTS+·的清除作用

按照1.5.4试验方法进行试验，以板栗壳多酚浓度为横坐标，以ABTS+·的清除率为纵坐标，板栗壳多酚清除ABTS+·的效果如图9。

图9 板栗壳多酚清除ABTS+·的效果Fig.9 Effects of scavenging ABTS+·on polyphenols from Chestnut Shell

ABTS经氧化后会生成蓝绿色ABTS+·，植物多酚可清除ABTS+·，从而使ABTS+·母液在一定程度褪色。由图9可看出，板栗壳多酚和VC都有清除ABTS+·的能力，且它们的清除能力都随着质量浓度的增加而增大。谢惠等[14]研究发现红枣多酚对ABTS+·有一定的清除能力，在一定范围内其清除能力随着红枣多酚浓度增加而增大，但其清除率明显低于VC。而本试验板栗壳多酚清除ABTS+·的能力优于VC，说明板栗壳多酚具有较好的清除ABTS+·的能力。

3.5 板栗壳多酚对亚硝酸盐的清除作用

按照1.5.5试验方法进行试验，以板栗壳多酚浓度为横坐标，以亚硝酸盐的清除率为纵坐标，板栗壳多酚清除亚硝酸盐的效果如图10。

亚硝酸钠在弱酸性的条件下，与对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺反应后会生成红色络合物，该红色络合物溶液在536 nm处有强吸收[15]。当有抗氧化剂存在时，红色络合物溶液会在一定程度褪色。由图10可看出，板栗壳多酚和VC都有一定的清除亚硝酸基的能力，它们的清除能力都随着质量浓度的增加而增大，且整体上板栗壳多酚的清除能力比VC更强。亚硝酸盐为强氧化剂，主要在腌肉、泡菜中出现，食用后经体内胃酸作用转化成亚硝胺，亚硝胺为强致癌物。因此，板栗壳多酚在该领域具有很好的应用潜力。

图10 板栗壳多酚清除亚硝酸盐的效果Fig.10 Effects of scavenging nitrite on polyphenols from Chestnut Shell

3.6 板栗壳多酚对羟自由基的清除作用

按照1.5.6试验方法进行试验，以板栗壳多酚浓度为横坐标，以·OH的清除率为纵坐标，板栗壳多酚清除·OH的效果如图11。

图11 板栗壳多酚清除·OH的效果Fig.11 Effects of scavenging·OH on polyphenols from Chestnut Shell

羟自由基能诱导DNA链断裂和碱基改性从而引发肿瘤等疾病。植物多酚可通过清除羟自由基来减少羟自由基的产生，此时在510 nm下吸光度会降低。由图11可看出，板栗壳多酚对羟自由基的清除作用随着多酚浓度的增加逐渐降低，出现该现象的具体原因有待进一步探究，而VC对羟自由基的清除能力随着质量浓度的增加逐渐增强。当板栗壳多酚浓度低于55 μg/mL时，其清除羟自由基的能力优于VC；当板栗壳多酚浓度高于55 μg/mL时，其清除羟自由基的能力弱于VC。

4 结论

1）利用超声波水提法从板栗壳中提取多酚化合物，通过正交试验得到影响板栗壳多酚提取因素的主次顺序为：C（超声板栗壳功率）＞B（超声时间）＞A（料液比）＞D（超声温度）；并得到最优提取工艺条件：A3B1C1D2，即液料比 1 ∶45（g/mL）、超声时间 1 h、超声功率350 W、超声温度65℃，在该提取工艺条件下板栗壳多酚的提取率达到96.9%。

2）板栗壳多酚总抗氧化能力优于VC，对5种抗氧化体系均有一定的清除能力，且在一定质量浓度下其对 DPPH·、ABTS+·、NaNO2和·OH 的清除效果优于VC。因此，板栗壳多酚是一种良好的天然抗氧化剂，在食品、药品和化妆品等领域具有广阔的应用前景。