玫瑰花多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究

梁启超，邹玉龙，张秀萍，吴宜艳，*，张朝立

（1.牡丹江医学院 药学院，黑龙江牡丹江157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院 药学部，黑龙江牡丹江157011）

玫瑰花是蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thunb.的初开放的花或干燥花蕾[1]，在全球范围内广泛种植，但多数分布于北半球，以中西欧，亚洲等国家为主；在我国的栽培历史悠久，目前在全国各地均有种植。玫瑰花甘温、微苦、无毒，具有利胆、预防心脏病、降血脂、抗菌等功效[2-6]，是一种良好的食药两用及观赏花卉，在化妆品、酿酒、制糖、糕点、制茶和饮料等行业广泛应用[7-9]，这些工业生产过程中，产生了大量含有多糖的玫瑰花渣。多糖为玫瑰花的重要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基、降血糖等作用[10-12]。以往玫瑰花多糖提取工艺常采用单因素试验和正交试验，但是这些方法预测性不佳[13-14]。本研究以玫瑰多糖得率为指标，在单因素试验考察基础上，应用星点设计-响应面法建立玫瑰花多糖得率与提取温度、提取时间和料液比3个因素的数学模型，优化玫瑰花多糖提取工艺。采用紫外-可见光谱、红外光谱扫描初步分析玫瑰花多糖结构，并进一步考察其体内抗氧化活性，为玫瑰花资源充分利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玫瑰花：安徽汉枫中药饮片公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px） 和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；D-无水葡萄糖、D-半乳糖：阿拉丁试剂公司；其他试剂国产分析纯；昆明小白鼠（雌性，20 g～24 g）：牡丹江医学院实验动物中心。

旋转蒸发器（R-250型）：上海申胜生物技术有限公司；高速冷冻离心机（L03GH型）：盐城市凯特实验仪器有限公司；真空冷冻干燥机（FDS-1000型）：东京理化器械株式会社；紫外可见分光光度计（Cary 300型）、红外光谱仪（Scimitor 800型）：美国瓦里安技术中国有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玫瑰花多糖的提取工艺流程

玫瑰花→粉碎（过40目筛）→石油醚脱脂（索氏提取，无水乙醇，各回流4 h）→真空室温干燥→准确称取经处理的玫瑰花粉末2.0 g，置于锥形瓶中→在选定的不同条件下热水提取玫瑰花多糖→提取液离心（3 500 r/min，10 min）→上清液经除蛋白、脱色→醇沉→离心（3 500 r/min，10 min）得沉淀→冷冻干燥→得玫瑰花多糖。

1.2.2 玫瑰花多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测量玫瑰花多糖含量。精密称取无水葡萄糖标准品20 mg，加水至250 mL容量瓶，摇匀，得标准品溶液。分别吸取 0、10、20、30、40、50 mL葡萄糖标准品溶液，加水稀释至50 mL容量瓶。分别量取不同浓度葡萄糖溶液各2 mL置于具塞试管中，加入5%苯酚1 mL，5 mL浓硫酸，摇匀，90℃下20 min，冷却至室温，以0号管为参比，在490 nm处测定其吸光值。以葡萄糖浓度C（g/L）为横坐标，吸光度A为纵坐标，得回归方程为A=0.108 8C+0.006 4，R2=0.999 3。将

1.2.1制得的玫瑰花多糖用双蒸水至500 mL容量瓶，得玫瑰花多糖提取液。准确吸取玫瑰花多糖溶液2mL，测定玫瑰花多糖样品吸光度，根据回归方程求出多糖溶液浓度，计算玫瑰花多糖得率。

1.2.3 玫瑰花多糖提取单因素试验

取预处理的玫瑰花粉末2.0 g，以双蒸水为溶剂，考察提取温度、提取时间和料液比对玫瑰花多糖提取率影响。按液料比 30 ∶1（mL/g），在温度分别为 50、60、70、80、90、100 ℃提取 240 min，考察提取温度对玫瑰花多糖提取率影响；在液料比30∶1（mL/g），提取温度90 ℃水浴下，分别提取 60、120、180、240、300、360 min，考察提取时间对玫瑰花多糖提取率影响；提取温度90 ℃，提取时间 240 min，分别考察液料比 15∶1、20∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL/g）时对玫瑰花多糖提取率的影响[15-16]。

1.2.4 响应面法优化提取工艺试验

根据星点试验设计原理，在单因素试验结果基础上，设计三因素五水平试验[17-18]，以玫瑰花多糖得率为指标作响应面图，优化玫瑰花多糖最佳提取工艺，并对结果验证。其因素水平编码表见表1。

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

1.2.5 玫瑰花多糖结构分析

紫外光谱分析：将多糖样品配成0.5 mg/mL的溶液，以蒸馏水为空白，用紫外分光光度计在200 nm～800 nm波长范围扫描。

红外光谱分析：取1 mg～2 mg玫瑰花多糖，与一定量溴化钾混合均匀，压片后，上红外光谱仪在波数为4 000 cm-1～400 cm-1波数下进行红外扫描。

1.2.6 玫瑰花多糖体内抗氧化活性

60只雌性小鼠，经1周环境适应性饲养，随机分为6组：空白对照组，衰老模型组，VC阳性对照组，玫瑰花多糖高、中、低剂量组。除对空白对照组小鼠每天颈背部皮下注射等体积的生理盐水外，其他5组均按每日颈背部皮下注射120 mg/kg剂量的D-半乳糖。与此同时，玫瑰多糖高、中、低剂量组分别以600、300、150 mg（/kg·d） 多糖灌胃给药，VC阳性对照组以150 mg（/kg·d）灌胃给药，空白对照组和衰老模型组小鼠灌胃相应体积生理盐水[19]。

实验第42天，所有小鼠停止药物干预，小鼠禁食不禁水24 h，以眼眶后静脉丛采集血样，4℃放置2 h后，离心（3 500 r/min，10 min）得血清，颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脏清洗后用预冷pH 7.4的磷酸缓冲溶液组织匀浆，3 000 r/min离心10 min上清备用。按照试剂盒说明书分别测定血清及肝组织中SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

1.3 数据处理

优化试验均重复3次，数据结果表示为平均值±标准误差，试验数据处理及分析采用Design-Expert 8.0.6软件；抗氧化试验采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，数据以平均值±标准误差表示，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 玫瑰花多糖提取单因素试验

提取温度、提取时间、液料比对玫瑰多糖提取率影响见图1。

从图1a结果可知，在50℃～90℃随提取温度上升，玫瑰花多糖得率显著增加，多糖得率最大值为90℃，温度从90℃提高到100℃，多糖得率有所降低，所以较合适的提取温度为90℃。图1b给出不同提取时间对多糖提取率影响。由图可知，随着提取时间的增加，玫瑰花多糖得率不断增加，在提取240 min达到了最大值，之后随着提取时间增加多糖得率轻微下降，因此，提取时间最终选择240 min为宜。由图1c可知，液料比从 15 ∶1（mL/g）到 30 ∶1（mL/g）玫瑰花多糖得率随液料比的增加而增加，30∶1（mL/g）时提取率最高，此条件下多糖基本提取完全，增大料液比对多糖得率增加较小，提取液料比选择 30 ∶1（mL/g）。

图1 提取温度、提取时间、液料比对玫瑰多糖提取率的影响Fig.1 Extraction temperature，time and liquid to solid ratio on extraction yield of RRPP

2.2 瑰花多糖提取单因素试验

2.2.1 响应面试验方案及结果

玫瑰花多糖得率用Design-Expert软件响应面处理，以玫瑰花多糖提取得率为响应值，对各影响因素进行二次回归分析，得到回归方程Y=1.37+0.14A+0.10B+0.057C+0.017 5AB-0.005AC-0.032 5BC-0.083A2-0.122B2-0.111C2。响应面试验方案及结果见表2。方差分析结果见表3。

方差分析显示，F值=15.888，回归模型显著性P＜0.000 1，表示回归方差模型极显著的，说明模型有意义。A、B、A2、B2、C2均有显著差异（P＜0.01），表明 3 个因素对玫瑰多糖的影响不是简单线性关系，同时，失拟项P＞0.05，即模型与试验比较吻合。R2adj=0.875 6表明该模型能解释87.56%的变化，相关系数R2=0.934 6，说明试验实际值与预测值有很好的相关性，可以用方程对提取结果进行预测。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design and results

表3 设计方差分析表Table 3 Analysis of variance of experimental results

2.2.2 因素间相互作用

因素相互作用对提取率影响的响应面图见图2。

图2 因素相互作用对提取率影响的响应面图Fig.2 The mutual effects of different factors on the extraction yield of RRPP

各因素的响应面分析图，可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，当A、B、C 3个因素取值较小时，响应面曲线较陡，等高线密度较大，此时各因素对玫瑰花多糖提取率影响较为明显，但A、B、C取值较大时，响应面曲线较平缓，等高线密度较小，说明此时3个因素对多糖提取率影响较小，等高线反应了各因素的相互作用，等高线越近乎于圆形表示因素相互作用越小，椭圆形表示相互作用较大，从等高线图可以看出 BC＞AB＞AC。

2.2.3 最佳工艺的验证试验

通过Design Expert 8.0.6优化，确定玫瑰花多糖提取的最佳工艺为：提取温95.41℃，提取时间256.35min，液料比30.51∶1（mL/g），该条件下多糖预测提取率1.46%。考虑试验的实际条件，确定实际最佳工艺为：提取温度95℃，提取时间256 min，液料比 30∶1（mL/g），进行3组验证性试验，实际提取得率分别为1.43%、1.45%、1.42%，平均值为1.43%，与理论预测值相差很小，试验证明预测值与实际值吻合性良好，说明星点设计响应面法对多糖提取工艺的优化方案可行。

2.3 玫瑰花多糖结构初步分析

多糖溶液在200 nm～800 nm波长范围内的吸收曲线如图3所示。

图3 玫瑰花多糖紫外吸收光图谱图Fig.3 Ultraviolet spectrum of Rosa rugosa petals polysaccharides

由图3可知，在260 nm和280 nm处未出现吸收峰，无其他杂质峰，表明玫瑰花多糖不含核酸和蛋白质等。玫瑰花多糖红外光图谱图见图4。

图4 玫瑰花多糖红外光图谱图Fig.4 Infrared spectrum of Rosa rugosa petals polysaccharides

由图4可知，3 433 cm-1处左右出现宽而强的吸收峰是多糖的O-H伸缩振动，在2 928 cm-1处左右出现的强吸收峰是多糖的C-H伸缩振动，1 345 cm-1处的收峰为多糖的C-H弯曲振动，这些峰是多糖物质的特征峰[20]。在1 748 cm-1和1 609 cm-1出现的吸收峰为C=O伸缩振动，表明多糖中含有糖醛酸[21]。在895 cm-1和878 cm-1处有吸收峰，表明玫瑰花多糖的糖苷键结构为β-D型吡喃糖。

2.4 玫瑰花多糖体内抗氧化活性

玫瑰花多糖对小鼠血清和肝脏SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响见表4。

表4 玫瑰花多糖对小鼠血清和肝脏SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响Table 4 Effect of RRPS on the activities of SOD，GSH-Px and the level of MDA in serums and livers in aging mice

由表4可知，与正常对照组比较，模型小鼠血清和肝脏中 SOD 及 GSH-Px活性明显下降（P＜0.01），MDA含量明显增高，存在显著性差异（P＜0.01），表明D-半乳糖致衰老模型成功。与D-半乳糖致衰老模型组相比不同剂量玫瑰花多糖组，小鼠血清和肝脏SOD和GSH-Px酶的活性均显著增加，MDA含量降低（P＜0.01）。多糖高剂量组的小鼠血清中SOD、GSH-Px酶的活性和 MDA 含量为（220.41±18.23）U/mL、（276.74±22.14）U/mL 和（7.30±0.50）nmol/mL；多糖高剂量组的小鼠肝脏抗氧化酶（SOD、GSH-Px）的影响和MDA含量为 （244.43±16.12）U/mg、（281.23±21.06）U/mg 和（10.56±0.84）nmol/mg。与衰老模型组相比多糖高剂量组血清和肝组织的SOD活性分别提高了18.17%、20.30%；GSH-Px活性分别提高了33.89%、33.32%；MDA含量降低45.77%、39.72%。这些结果表明，玫瑰多糖可显著提高小鼠血清和肝脏中抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性，明显抑制小鼠血清和肝组织中MDA含量的增加，有效减轻氧化损伤，表现出很强的体内抗氧化活性。

3 结论

采用响应面法优化的玫瑰花多糖的最佳提取工艺为：提取温度95℃，提取时间256 min，液料比30∶1（mL/g），在此工艺条件下，多糖提取得率为1.46%。此优化提取工艺参数准确、可行，在试验范围内能较准确地预测玫瑰花多糖的得率，为玫瑰花多糖的提取工艺提供参考，为玫瑰花资源充分利用提供试验依据。

玫瑰多糖可以显著提高小鼠血清和肝组织中内源性抗氧化酶活性（SOD、GSH-Px），明显抑制小鼠血清和肝组织中MDA含量的增加，有效减轻氧化损伤，表现出很强的抗氧化活性，是一种具有开发潜力的天然抗氧化剂。