白纹伊蚊雌蚊唾液腺匀浆血小板聚集抑制与抗凝血活性的探讨*

李世琪 闫 妍 翟 慧 王政艳 程金芝** 吴家红**

(1. 贵州医科大学环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室，贵州医科大学现代病原生物学实验室，贵州医科大学基础医学院；贵州贵阳 550025； 2. 淮北矿工总医院皮肤科，安徽淮北 235000)

白纹伊蚊Aedesalbopictus，又称“亚洲虎蚊”，起源于亚洲，现已扩散至全球70多个国家，不仅刺叮吸血，而且可以传播登革热、基孔肯雅热、寨卡热等重要的虫媒疾病(陆宝麟，1999; Liuetal., 2017)，成为全球重要的媒介蚊虫之一(杨舒然等, 2013)。在我国，它北至辽宁，南至海南。

通过吸血，媒介蚊虫不仅可以获得营养、繁殖后代，还可以通过唾液与宿主发生相互作用，促进病原的传播。为获取血餐，吸血节肢动物进化了一系列的具有生物学活性的唾液组分蛋白以对抗宿主的凝血机制和免疫反应，包括血液凝集抑制剂、血小板聚集抑制剂、血管收缩剂以及免疫调控分子等。现有研究表明这些生物活性物质具有种特异性。物种不同，唾液组分中的抗凝血、免疫调控的机制也不相同(Kazimírováetal., 2002; Wanasenetal., 2004)。

蚊虫唾液是一组具有潜在药理活性的液体，不仅可干扰宿主的凝血反应、炎症反应以促进吸血的完成，更重要的是可调控宿主的免疫反应，促进病原的传播(吴家红等, 2008)。白纹伊蚊作为我国重要的媒介蚊虫之一，对白纹伊蚊雌蚊唾液组分生物学活性的研究鲜有报道。本研究以白纹伊蚊唾液腺匀浆粗蛋白(salivary gland extract，SGE)为研究对象，探究其在宿主血小板聚集及血液凝集过程中可能发挥的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 蚊虫和血液来源

蚊虫：白纹伊蚊广州株2006 年 8 月引自军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，在本研究室常规养殖。温度 25℃±2℃，湿度为(80±5)%，光照14 h/d，羽化后喂食10%葡萄糖溶液。

血液来源：健康志愿者静脉血。健康志愿者纳入标准为14 d内无任何服药史，无冠心病及其家族史，无高血压、高血脂、高血糖，经一般生化检查未见明显凝血功能异常。同时排除有血小板功能障碍病史，以及血液系统疾病者。年龄在 20～30 岁之间共6人(3男，3女)，每人于肘静脉取血30 mL。采集和使用均遵守医学伦理学的相关规定。

1.2 主要试剂和仪器

Ⅰ型胶原、凝血酶购自北京solarbio试剂公司；ADP购自美国Sigma公司；凝血酶时间(TT)测定试剂盒、凝血酶原时间(PT)测定试剂盒、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒均购自上海太阳生物技术有限公司；Micro BCA Protein Assay kit (Pierce, Rockford, IL)购自宝生物公司；血小板聚集仪(LBY-NJ4)为北京普利生仪器有限公司产品；M530酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 白纹伊蚊雌蚊唾液腺匀浆粗蛋白样品制备

采用剥头法解剖白纹伊蚊雌蚊唾液腺。取3～5日龄未吸血雌蚊唾液腺置于100 μL冰浴PBS中。每管置入唾液腺100对，充分匀浆后于4℃，12 000 r/min离心20 min，吸取上清保存于-80℃备用。根据蛋白检测试剂盒说明书配置标准蛋白样品溶液和工作液，570 nm下测定吸光度值，绘制标准曲线。取上述制备好的SGE 25 μL，加入到含有 200 μL 工作液的酶标板中，37℃孵育 30 min 后在 570 nm 下测定吸光度值，重复3孔，求平均值；利用标准曲线计算其浓度。

1.4 SGE抗血小板聚集作用

1.4.1富血小板血浆及贫血小板血浆的制备: 肘静脉取血 20 mL，用 0.109 mol/L枸橼酸钠溶液与全血(1∶9)体积比混合抗凝。以1000 r/min离心10 min。得到上层液即为富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)，余下血样以 3 600 r/min 离心10 min，得到贫血小板血浆(platelet poor plasma, PPP)。用 PPP 调整 PRP 中的血小板数为 3×1011个/L。制备好的 PRP 应在2 h内用完。

1.4.2SGE抗血小板聚集作用: 将低、中、高浓度SGE(0.033、0.1、0.1667 μg/μL)分别与PRP 37℃预温5 min，空白对照加入等体积PPP，分别以ADP(5 mmol/L)、Ⅰ型胶原蛋白(5 mg/mL)、凝血酶(1 U/mL)为诱导聚集剂，采用比浊法测定血小板5 min最大聚集率，并计算血小板聚集抑制百分率。血小板聚集抑制百分率(%)=[(对照组血小板聚集率%-实验组血小板聚集率%)/对照组血小板聚集率%]×100%(Kazimírováetal.,2002)。

1.5 SGE抗凝集活性检测

1.5.1血浆制备: 采集健康人静脉血6 mL, 用 0.109 mol/L枸橼酸钠溶液与全血(1∶9)体积比混合抗凝，采集完立即轻柔颠倒混匀。3 000 r/min离心 5 min，取上层血浆，用于活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)检测。

1.5.2部分活化凝血酶时间(APTT)检测: 按照操作说明书进行。简言之，在96孔酶标板中每孔加入健康人血浆0.1 mL，然后分别加入终浓度为 1.25、6.25、32.5、62.5 ng/mL SGE 20 μL,对照组加入等量PBS。加入37℃预热的APTT试剂 0.1 mL, 37℃孵育 5 min。最后加入37℃预热的 25 mmol/L CaCl2溶液 0.1 mL。记录出现丝状纤维或凝固的时间。

1.5.3凝血酶原时间(PT)检测: 按照操作说明书进行。简言之，在96孔酶标板中每孔加入健康人血浆0.1 mL，然后分别加入终浓度为 1.25、6.25、32.5、62.5 ng/mL SGE 20 μL,对照组加入等量PBS。37℃孵育 3 min，加入37℃预温 PT 试剂 0.2 mL，取一细针搅拌混合液，记录出现丝状纤维时间或混合液凝固时间。

1.5.4凝血酶时间(TT)检测: 按照操作说明书进行。简言之，在96孔酶标板中每孔加入健康人血浆0.1 mL，然后分别加入终浓度为 1.25、6.25、32.5、62.5 ng/mL SGE 20 μL,对照组加入等量PBS。加入 TT 试剂 0.1 mL，取一细针搅拌混合液。记录出现丝状纤维或混合液凝固的时间。所有实验重复3次。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 SGE对血小板聚集作用的影响

将低、中、高3个浓度(0.033、0.1、0.167 μg/μL)SGE与PRP孵育后，加入3种诱导聚集剂，结果见图1。低、中与高浓度组SGE作用下，Ⅰ型胶原诱导组的血小板聚集抑制作用显著(P<0.01)，最高可达90.36%的聚集抑制率，并显示出一定的量效关系；凝血酶诱导组在高浓度SGE作用下血小板聚集即有显著抑制作用(P<0.05)，聚集抑制率达50.08%；在3种浓度SGE作用下，ADP诱导组血小板聚集抑制作用不显著。

图1 白纹伊蚊雌蚊低、中、高浓度SGE对3种激活剂诱导下血小板聚集的作用(n=3)Fig.1 Effect of low-, medium-, high-dose SGE of Ae. albopictus female mosquitoes on human platelet aggregation induced by collagen Ⅰ, ADP or thrombin (a: P <0.05).

2.2 抗凝血活性

将不同浓度的白纹伊蚊雌蚊SGE作用于人全血，观察了SGE对APTT、PT、TT的影响。如表1所示，随着SGE浓度的增加，APTT、PT、TT均有延时效应；其中APTT延时效应具有剂量依赖性，但在31.25 ng/mL以上组才有统计学差异；TT在1.25 ng/mL组，延时即有统计学差异。

表1 白纹伊蚊雌蚊不同浓度SGE作用下对人全血APTT、PT、TT的影响 (n=3)Tab.1 Effect of different concentrations SGE of Ae. albopictus female mosquitoes on human APTT, PT, TT (n=3)

*:P<0.05; **:P<0.01.

3 讨论

脊椎动物宿主有一个高度复杂、冗余、高效的凝血系统,主要包括局部血管的收缩、血小板聚集和血液级联凝集。当组织受损时，血小板聚集是避免血液丢失的第一道屏障。Reiberio 等(2000)的研究显示Ae.aegypti、Anophelesalbimanus和Culexquinquefasciatus雌蚊SGE均可显著抑制凝血酶、胶原、ADP诱导的血小板聚集。蚊种不同，针对不同血小板聚集诱导剂作用的效率也是不同的。本研究结果发现在低浓度SGE作用下，即可显著抑制胶原诱导的血小板聚集，随着SGE浓度的上升，聚集抑制率显著上升，最高达90.36%的抑制效率，有明显的量效关系。据此推测白纹伊蚊唾液组分内可能具有高效的抑制胶原诱导的血小板聚集的物质。事实上，Aegyptin——某个分离自Ae.aegypti唾液腺的变应原蛋白，可特异性与胶原结合，抑制血小板粘附、活化、聚集(Calvoetal., 2007，2010)。当前已在白纹伊蚊唾液腺内克隆并表达了同源蛋白(李星潘等, 2014)， 至于SGE抑制胶原诱导的血小板聚集是否与该蛋白活性相关还有待进一步研究。本研究中，凝血酶诱导组，高浓度SGE作用才可显著抑制血小板聚集抑制，抑制率为50.08%，提示白纹伊蚊唾液内具有抗凝血酶的物质。该研究结果与Ae.aegyptiSGE 对凝血酶诱导的血小板聚集抑制率是基本一致的(Reiberio，2000)。Watanabe等(2010)的研究发现Ae.aegypti唾液内有AaT1蛋白，是一种Kazal-type抑制剂，体外具有较弱的凝血酶抑制活性。有趣的是，An.albimanusSGE对凝血酶诱导的血小板聚集抑制率可高达100%，同时在An.albimanus唾液组分内发现一种蛋白anophelin，具有高效的抗凝血酶作用(Valenzuelaetal., 1999)，作者因此认为该蛋白是抑制凝血酶诱导的血小板聚集的主要原因(Reiberio，2000)。最近的一项研究显示按蚊属蚊虫均有anophelin的同源蛋白，尽管氨基酸序列一致性低于50%，但是均具有强抗凝血酶的作用(Figueiredoetal., 2012)。ADP是一个重要的血小板聚集诱导剂，本研究显示低、中、高浓度SGE作用下，ADP诱导的血小板聚集抑制差异并不显著。这一研究结果与Reiberio(2000)对Ae.aegyptiSGE的结果不一致。当前在伊蚊属、按蚊属、库蚊属多种蚊虫体内均已分离到Apyrase,该酶主要作用是将ADP水解成磷酸腺苷(AMP)和磷酸根，从而达到抑制血小板聚集的作用(Champagneetal., 1995; Andradeetal., 2005)；蚊虫种属不同，其Apyrase活性是不一样的，从而表现出来的ADP诱导的血小板聚集抑制效率也是不一样的(Reiberio，2000)。基于本研究结果，推测白纹伊蚊雌蚊SGE内的apyrase酶活性可能比较低。

血液级联凝集是脊椎动物宿主抗凝血的第3步，包括内源性凝集途径和外源性凝集途径。通过凝血因子的级联激活，从而最终激活凝血酶原，催化纤维蛋白原分解形成纤维蛋白，加固血小板栓。本研究选择APTT、PT、TT来探讨SGE 对血液级联凝集抑制的影响。APTT是部分凝血活酶时间，可反映血浆中凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ水平,是内源性凝血系统较敏感和常用的筛选实验因子。PT是血浆凝血酶原时间，可反映血浆中凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平,是外源性凝血系统的筛选检测因子。TT则反映血液凝集的最后一步。本研究结果显示，SGE可使APTT、PT、TT延时，说明SGE可作用于血液级联凝集的各个环节，但作用效率有所不同。对其他吸血昆虫SGE的抗凝血活性研究也证实了这一点(Chagasetal., 2010; Borahetal., 2014)。由此可见，吸血已经导致昆虫进化了不同的分子参与抵抗宿主的血液凝集反应。种类不同，其反应的机制也不尽相同。在Ae.aegypti唾液腺内发现至少2个蛋白参与这一过程。FXa抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，主要抑制凝血因子X的活化，从而起到抗凝血的作用(Starketal.,1998)；Ae.albopictus唾液腺内也分离到FXa 抑制剂的同源蛋白并证实了其功能，推测FXa抑制剂参与了SGE的抗凝血功能(Calvoetal., 2011)。此外，AaT1，一个来源于Ae.aegypti的对凝血酶有弱抑制作用的蛋白，可显著延长APTT、PT、TT，说明它可能还有其他的功能活性，也参与Ae.aegyptiSGE的抗凝血活性(Watanabeetal., 2010)。

终上，本研究结果初步显示白纹伊蚊SGE不仅对不同诱导剂诱导的血小板聚集有差异的抑制作用，而且在抗凝血活性也表现了差异，表明SGE是一种具有多种生物学活性的蛋白组分，不同的组分蛋白针对脊椎动物宿主凝血途径中的不同环节发挥相同和/不同的作用。然而，由于唾液腺匀浆毕竟是粗蛋白，蛋白混杂，因此本研究结果是初步的，后续还需要进一步的研究证实。