布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮发酵、干物质回收率和营养价值的影响

成娟丽，林金水

（延安大学生命科学学院，陕西延安 716000）

目前，各类微生物制剂被用于提高青贮玉米发酵效率，其中乳酸菌菌剂作为最安全有效的添加剂常被应用于各类青贮饲料。然而，这种类型微生物制剂产生较少的较强抗真菌特性的有机酸，会使青贮饲料在开窖后变得不稳定。相比之下，有研究报道，在青贮饲料中添加布氏乳酸菌（Lactobacillus buchneri，异型发酵乳酸菌）可以通过厌氧生产乙酸来提高好氧稳定性（王旭哲等，2018）。大部分学者已经肯定并接受了布氏乳杆菌对青贮饲料有氧稳定性的积极作用，但仍有学者认为其会造成干物质损失（Kleinschmit 和Kung，2006）。有研究发现，可通过在青贮饲料中混合添加微生物制剂解决干物质损失这一问题。Filya（2013）发现，将布氏乳酸菌与植物乳杆菌混合添加到玉米青贮中会降低干物质含量，但减低程度小于布氏乳酸菌单独添加组。张淑枝等（2007）研究发现，植物乳杆菌和乳酸片球菌的接种剂能显著提高玉米青贮饲料的干物质含量。因此，本试验的目的是比较布氏乳杆菌与乳酸片球菌或植物乳杆菌联用对玉米青贮发酵、好氧稳定性和营养价值的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 青贮玉米原料：试验选用新饲玉10号作为青贮原料。在青贮玉米干物质含量约为320 g/kg时收割并切碎。微生物添加剂：布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验设计 3个容量为20 L的筒仓用于青贮玉米。试验分为3个处理：（1）对照组，不加任何菌剂；（2）布氏乳杆菌+乳酸片球菌组，添加量分别为 4×105、1×105CFU/g；（3）布氏乳杆菌 +植物乳杆菌组，添加量分别为 4×105、1×105CFU/g。各菌种在MRS液体培养基中培养，平板计数后确定其数量后按比例配置菌液。菌液与去离子水混合后用灭菌喷壶均匀喷洒至待贮青贮玉米表面，对照组处理喷洒等量的去离子水。每个筒仓内装大约15 kg的湿饲料，以达到230 kg干物质/m3的包装密度，记录空仓和满仓的重量。将筒仓用氧气隔离塑料密封，室温15～28℃青贮。180 d后对所有筒仓称重，分离顶部可见的腐败物并称重。筒仓重量减去可见变质青贮饲料的重量是发酵后剩余青贮饲料的重量。将青贮饲料部分没有可见腐坏部分充分混合，并采集样品进行分析。干物质回收率计算公式如下：

干物质回收率/%＝[（开封时回收青贮重×青贮干物质%）／（装填时装入原料重×原料干物质 %）]×100。

1.3 测定方法 干物质含量采用105℃烘干法测定；粗蛋白质采用凯氏定氮法测定；淀粉采用酶水解法测定；利用酸度计测定pH；挥发性脂肪酸、乙醇和1，2-丙二醇用液相色谱法测定采用高效液相色谱法；氨态氮采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；水溶性碳水化合物蒽酮比色法测定；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维采用范氏洗涤纤维法测定；采用离体法测定玉米青贮饲料样品中中性纤维消化率；微生物数量采用平板计数法计数，乳酸菌（30℃，48～ 72 h）、霉菌（32℃，48～ 72 h）、酵母菌（32℃，48～72 h）分别用MRS培养基、高盐察氏培养基、麦芽糖浸粉琼脂培养基进行培养。选择菌落数在30～300个平板为平板计数菌落总数。有氧稳定性测定主要观测各处理开仓后温度变化，青贮饲料温度高于环境温度2℃所用的时间即为有氧稳定时间。取筒仓底部3 kg饲料至新筒仓中，将多点式温度记录仪器多个探头至于饲料中心，每10 min记录一次温度。

1.4 统计分析 本实验采用完全随机设计，利用SAS一般线性模型进行方差分析。Tukey’s进行差异性比较，以P＜0.05作为差异性显著。

2 结果与分析

2.1 玉米青贮原料微生物数量和营养组成 由表1所示，全株玉米干物质的含量为325 g/kg，其他营养成分均在正常范围内。

表1 玉米青贮原料微生物数量和营养组成

表2 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮感官评定

2.2 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮感官评定 由表2所示，3组青贮玉米在气味质地上均差异不大，仅在颜色、酸味、质地3项指标有略微差别。相比于接种乳酸菌制剂组，未经处理的青贮饲料筒仓表面有相当大比例的青贮饲料明显变质。综合感官评定结果为对照组为良好，布氏乳杆菌+乳酸片球菌组为优等，布氏乳杆菌+植物乳杆菌组为优等。

2.3 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮干物质回收率、养分含量及中性纤维消化率的影响 由表3所示，与对照组相比，布氏乳杆菌+乳酸片球菌组显著增加了（P＜0.05）干物质回收率，显著降低了（P＜0.05）水溶性碳水化合物含量；布氏乳杆菌+植物乳杆菌组显著增加了（P＜0.05）干物质回收率、酸性洗涤纤维含量、中性纤维消化率，显著降低了（P＜0.05）水溶性碳水化合物含量；氮、氨态氮、中性洗涤纤维的含量不受各组处理影响（P＞0.05）。

表3 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮干物质回收率、养分含量及中性纤维消化率的影响                                  g/kg

2.4 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮微生物数量的影响 由表4所示，与对照组相比，布氏乳杆菌+乳酸片球菌组与布氏乳杆菌+植物乳杆菌组显著增加了（P＜0.05）乳酸菌的数量，而酵母的数量极低，几乎无法检测到（P＜0.05）。霉菌数量不受各组处理影响（P＞0.05）。以上指标在布氏乳杆菌+乳酸片球菌组和布氏乳杆菌+植物乳杆菌组之间无显著差异（P＞0.05）。

表4 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮             微生物数量的影响    log CFU/g

2.5 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对pH、发酵产物和有氧稳定性的影响 由表5所示，与对照组相比，布氏乳杆菌+乳酸片球菌组和布氏乳杆菌+植物乳杆菌组显著降低了（P＜0.05）pH、乙醇含量，显著增加了（P＜0.05）乙酸含量、1，2-丙二醇和有氧稳定性。与布氏乳杆菌+植物乳杆菌组相比，布氏乳杆菌+乳酸片球菌组显著增加了（P＜ 0.05）pH、乙酸含量、1，2-丙二醇含量，显著降低了（P＜0.05）乙醇含量、乳酸含量。

表5 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对pH、发酵产物和有氧稳定性的影响

3 讨论

近年来，为提高有氧稳定性并防止青贮饲料变质，布氏乳杆菌作为青贮添加剂添加到青贮饲料中（洪梅等，2011）。但有研究发现，添加布氏乳杆菌会导致更高的干物质损失。Kleinschmit 和Kung（2006）利用荟萃分析发现，与未经处理的青贮饲料相比，青贮饲料中添加布氏乳杆菌会降低干物质回收率。一些研究发现，布氏乳杆菌与其他乳酸菌剂联合使用可以弥补布氏乳杆菌单独添加造成的发酵损失（Driehuis等，2001）。本试验研究结果与其一致，布氏乳杆菌植物乳杆菌或乳酸片球菌联用可提高干物质回收率。

在生产实践中，有氧稳定性代表青贮饲料对温度升高的抵抗力。本试验结果显示，布氏乳杆菌植物乳杆菌或乳酸片球菌联用可提高玉米青贮饲料的有氧稳定性。青贮饲料主要依靠乳酸菌进行厌氧发酵产生乳酸，抑制不良微生物生长，减少营养损失。植物乳杆菌和乳酸片球菌均为同型发酵乳酸菌，它们在发酵过程中占主导地位，使乳酸成为主要的发酵产物。Wang等（2015）在有氧暴露期间，同型发酵乳酸菌所产生的乳酸可作为酵母菌生长的底物，仅产生少量能抑制酵母菌和霉菌生长的短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）。而异型发酵的布氏乳杆菌在青贮饲料中成为优势菌群后通过显著增加乙酸和1，2-丙二醇浓度，产生细菌素或类细菌，有助于提高青贮饲料的有氧稳定性并改善青贮品质。因此，该结果表明，布氏乳杆菌在青贮中占主导地位。后续的微生物及发酵产物等数据也证实了这一结论。与未处理的玉米青贮饲料相比，布氏乳杆菌和乳酸片球菌或植物乳杆菌联合接种显著增加了玉米青贮饲料中乳酸菌的数量，乙酸和1，2-丙二醇浓度，显著降低了pH、酵母数量和乳酸浓度。Schmidt等（2008）通过实时荧光定量PCR测定发现，布氏乳杆菌数量在其接种的青贮饲料中显著提高，在发酵第240天已成为饲料中的主导菌群。我们还发现，布氏乳杆菌+乳酸片球菌组在增加乙酸1，2-丙二醇含量，降低乙醇含量、乳酸含量等指标优于布氏乳杆菌+植物乳杆菌组。然而，Shockey等（1985）研究表明，玉米青贮添加乳酸片球菌和植物乳杆菌不影响乳酸及乙酸浓度，对于pH的降低也无影响。因此，该作用机制需进一步探索。

此外，布氏乳杆菌和乳酸片球菌或植物乳杆菌联合添加对青贮饲料中氮和氨态氮的含量未有影响，与Kleinschmit和Kung（2006）报道相似，该研究发现，在玉米和小谷物类等青贮饲料中单独接种布氏乳杆菌并未影响氮和氨态氮。水溶性碳水化合物含量在接种布氏乳杆菌和乳酸片球菌或植物乳杆菌的青贮饲料中减少，可能与该组青贮玉米含有较高发酵微生物有关。与未处理的玉米青贮相比，联合接种布氏乳杆菌和乳酸片球菌或植物乳杆菌不影响玉米青贮的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，可能与植物乳杆菌和乳酸片球菌接种剂通常对纤维无降解能力有关。该结果与前人报道一致（Kleinschmit 等，2005；Ranjit和 Kung，2000）。

除了提高干物质回收率和好氧稳定性，一些微生物制剂还可提高青贮饲料的消化率。Weinberg等（2007）提出，一些添加到青贮饲料的微生物制剂可能通过与瘤胃中的微生物竞争，导致乳酸含量降低，瘤胃pH升高，有利于瘤胃的纤维溶解细菌生长。因此，青贮饲料中接种微生物制剂可以提高纤维在瘤胃中的消化。Weinberg等（2007）研究发现，在玉米青贮饲料中添加布氏乳杆菌可提高体外瘤胃对中性洗涤纤维的消化。但一些研究发现，在玉米青贮饲料中添加布氏乳杆菌对纤维消化没有影响。Nsereko等（2008）提出，在青贮饲料中添加表达阿魏酸酯酶的乳酸菌可以提高纤维消化率。这种酶有可能从木质素中分离半纤维素来提高纤维的消化率。布氏乳杆菌菌株PTA6138具有阿魏酸酯酶活性，与干酪乳杆菌PTA6315联用可以提高玉米青贮饲料的中性纤维消化率（Kang等，2009）。本试验中未对该布氏乳杆菌株是否具有阿魏酸酯酶活性进行验证，布氏乳杆菌和乳酸片球菌联用对中性纤维消化率无影响，而布氏乳杆菌和植物乳杆菌联用可提高中性纤维消化率，该结果有待进一步研究。

4 结论

综上所述，布氏乳杆菌与植物乳杆菌或乳酸片球菌联用可提高干物质回收率、改善玉米青贮发酵品质、降低有害微生物数量、提高有氧稳定性。